Approche ostéo-organoïde in vivo pour la récolte de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques

Nous sommes depuis longtemps engagés dans la recherche sur les biomatériaux, en introduisant le concept pionnier des biologistes des matériaux en développement de virus, de matériaux de réparation osseuse active et de technologues pour les facteurs de croissance, la préparation et l’activation. Nous avons développé une approche ostéo-organoïde in vivo utilisant des matériaux bioactifs pour réaliser une production à la demande de nodules automatiques, de tissus et de cellules pour le traitement des maladies. La technologie traditionnelle de l’expansion individuelle des cellules souches se heurte à des limites dans le maintien des fonctions physiologiques des cellules souches.

Notre protocole construit un microenvironnement de cultures individuelles pour assurer une quantité abondante de cellules souches tout en préservant leur stimulus. Pour commencer, placez la solution mère humaine recombinante et l’éponge de gélatine non ouverte sur une paillasse propre et stérile. À l’aide de ciseaux stérilisés, coupez l’éponge de gélatine en 48 morceaux de taille uniforme et transférez-les dans une assiette à 48 puits.

Pipetez plusieurs fois la solution mère humaine recombinante pour bien la mélanger. Aspirez 30 microlitres de la solution et ajoutez-la goutte à goutte à l’éponge de gélatine. Ensuite, scellez la plaque à 48 puits avec une couche de parafilm.

Retirez la plaque du banc propre et placez-la à une température de moins 20 degrés Celsius. Pour commencer, transférez la souris anesthésiée dans la zone chirurgicale et positionnez-la en position couchée latérale droite pour faciliter l’implantation de l’échafaudage bioactif dans la jambe gauche. À l’aide d’une machine à raser, rasez les poils de la jambe gauche et désinfectez la zone rasée en alternant des rondelles de chlorhexidine et d’alcool, trois fois chacune.

Après avoir fait l’incision, insérez des ciseaux ophtalmiques dans le muscle de la poche en direction du tibia afin de laisser de l’espace pour l’implantation ultérieure du matériel. Maintenant, prenez l’échafaudage bioactif préparé chargé avec de l’homme recombinant et à l’aide d’une pince ophtalmique, pincez-le en une forme cylindrique. Implantez l’échafaudage dans la poche musculaire le long de la fente créée précédemment.

Après 12 semaines d’implantation, anesthésez la souris et séparez soigneusement le membre postérieur du tronc. À l’aide de ciseaux miniatures, retirez méticuleusement le tissu musculaire des ostéo-organoïdes. Éliminez tous les tissus mous attachés à l’aide de gaze pour assurer un échantillon d’ostéo-organoïdes propre.

Fixer une partie des ostéo-organoïdes dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 heures à température ambiante pour une analyse histologique. Pour commencer, récoltez des ostéo-organoïdes de souris implantées avec un échafaudage contenant des ostéo-organoïdes humains recombinants dans un mortier, et ajoutez un millilitre de HBSS, sans ions calcium et magnésium. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour hacher les échantillons, puis écrasez-les doucement dans un mortier et un pilon.

Passez le résultat en suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 40 micromètres. Ensuite, centrifugez-le à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant.

Remettez les granulés de cellules en suspension dans 300 microlitres de HBSS et mélangez bien pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. Placez la souris anesthésiée et irradiée sublétalement sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius. Après s’être assuré d’une anesthésie complète, positionnez la souris en position latérale gauche avec sa tête orientée vers la droite.

À l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 25, aspirer 200 microlitres de la suspension cellulaire préparée. Pour exposer l’œil pour la procédure, placez un doigt sur le dessus de la tête et le long de la mâchoire, et tirez doucement la peau vers l’arrière et vers le bas. Insérez soigneusement l’aiguille avec le biseau vers le bas dans le canthus médial de l’œil à un angle d’environ 30 degrés.

Suivez doucement le contour du globe oculaire avec l’aiguille jusqu’à ce qu’il atteigne la base de l’œil. Injectez la suspension cellulaire en douceur et lentement dans la zone désignée. Une fois l’injection terminée, remettez la souris dans sa cage pour permettre la récupération.