Notre méthode rend possibles les investigations subcellulaires mécanistes dans le domaine en évolution rapide de la mécanobiologie en fixant les modifications protéiques temporaires en place, puis en les détectant avec des anticorps spécifiques. Cette méthode est techniquement facile à appliquer. Les résultats sont très valables et reproductibles.
De plus, par rapport à d’autres techniques, notre méthode pourrait vraiment être utilisée efficacement dans le domaine émergent de la signalisation post-traductionnelle des globules rouges, qui dépend de modifications temporaires des protéines, en particulier la mécanosignalisation des globules rouges. Pour effectuer la fixation des protéines de globules rouges, diluer le sang total dans un rapport de un à deux dans une solution de paraformaldéhyde à 4% pendant 20 minutes à température ambiante. Centrifuger la solution sanguine à 132 g pendant trois minutes à température ambiante et retirer délicatement le surnageant.
Remettez en suspension la pastille de globule de globule de globule de globule en deux volumes de PBS 0,1 molaire et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Encore une fois, centrifuger l’échantillon et retirer le surnageant avant de remettre en suspension la pastille de globule rouge dans un volume de 0,1 molaire de PBS. Étiquetez une lame de microscope avec l’ID de l’échantillon et l’anticorps appliqué à l’aide d’un stylo résistant à l’alcool.
Ajouter 10 microlitres de la solution de globule rouge préparée. Placez une deuxième lame sur l’échantillon à un angle de 45 degrés et dispersez l’échantillon uniformément le long de la lame. Fixez la lame à chaud en faisant passer l’échantillon au-dessus du brûleur Bunsen avec un mouvement constant pendant cinq à sept secondes.
Pour la coloration immunohistochimique, marquez la zone 2/3 de la lame comme test et 1/3 comme témoin à l’aide d’un crayon à graisse. Ensuite, lavez les zones d’échantillon deux fois en appliquant TBS pendant 30 secondes. Après le deuxième lavage, ajoutez 0,1% de trypsine et couvrez la lame à l’aide d’une chambre d’incubation spécialement conçue avec un couvercle.
Incuber l’échantillon pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Remplissez un bécher avec de l’eau du robinet et arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant l’eau du robinet du bécher sur la lame. Versez la solution et lavez les deux zones trois fois avec TBS.
Après le lavage final, ajouter la solution bloquant la peroxydase et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, verser la solution et laver les deux zones trois fois avec TBS. Ajouter ensuite la solution de lait écrémé à 3% et incuber pendant 30 minutes.
Après l’incubation, verser la solution et ajouter la solution d’anticorps primaires dans la zone d’essai. Ajouter la solution de contrôle des anticorps à la zone de contrôle. Incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, versez la solution d’anticorps et lavez les deux zones trois fois avec TBS. Ajoutez ensuite une solution de sérum de chèvre normale à 3% pour éviter une liaison non spécifique et incuber pendant 30 minutes. Après l’incubation, ajouter une solution d’anticorps secondaire et incuber pendant 30 minutes.
Versez la solution d’anticorps et lavez les zones trois fois avec TBS avant de procéder au développement de la coloration. Ensuite, pour effectuer une réaction de peroxydase de raifort couplée à l’avidine, ajoutez une solution diluée d’avidine peroxydase et incuber pendant 30 minutes. Placez la lame sous un microscope à un grossissement de 200 fois et ajoutez une solution de DAB fraîchement préparée aux deux zones.
Surveillez la coloration des globules rouges en continu et arrêtez la coloration en retirant la solution DAB avec une pipette jetable avant que l’arrière-plan ne commence à colorer. Pour effectuer la déshydratation de l’échantillon, placez la lame dans une grille en verre et plongez pendant cinq secondes chacune dans des concentrations croissantes d’éthanol et, enfin, dans du xylol. Après la déshydratation, placez la lame sur du papier de soie avec les globules rouges en haut pour absorber l’excès de liquide.
Ajouter deux ou trois gouttes de support de montage sur un bordereau de couvercle et couvrir la lame à l’aide du bordereau de couverture. Pour la visualisation et l’imagerie, placez la lame dans un microscope à lumière transmise couplé à une caméra. Allumez la source lumineuse et l’appareil photo et démarrez le logiciel.
En mode Champ clair, concentrez les globules rouges en tournant les boutons de réglage de la mise au point grossiers et fins. De même, concentrez les globules rouges en mode fluorescent. Pour analyser la valeur de gris RBC, marquez le bord de chaque RBC à l’aide de l’outil de sélection ovale du logiciel ImageJ.
À l’aide de la commande Mesurer, mesurez les valeurs de gris de 50 RBC du test et de 10 RBC du contrôle. Pour la coloration immunofluorescente des protéines rouges, incuber l’échantillon avec un anticorps secondaire conjugué par fluorescence pendant 30 minutes à température ambiante, en le protégeant de la lumière. Après l’incubation, versez la solution d’anticorps et lavez la lame trois fois avec TBS.
Laisser le TBS sur l’échantillon après le lavage final. Déshydrater l’échantillon et préparer la lame avec un couvercle pour l’évaluation microscopique comme démontré. Allumez le microscope et la source lumineuse fluorescente, puis faites la mise au point des globules rouges en mode Champ clair.
Capturez des images en fond clair et fluorescentes dans au moins trois zones distinctes de la zone de test de la diapositive sélectionnée au hasard. Réglez le temps d’exposition sur une seconde pour les images fluorescentes et capturez une image. Passez ensuite en mode Champ clair, réglez le temps d’exposition sur Auto et capturez l’image en champ clair correspondante.
Enregistrez les images au format TIFF. Capturez des images fluorescentes et en champ clair dans au moins deux zones distinctes sélectionnées au hasard de la zone de contrôle de la diapositive. Enregistrez les images au format TIFF pour préserver les valeurs de gris d’origine des pixels, empêcher la compression et transporter les métadonnées de l’acquisition.
Pour mesurer les valeurs de gris des GRC capturés, ouvrez ImageJ. Marquez chaque cellule avec l’outil de sélection ovale et analysez à l’aide de la commande Mesurer. Mettez en surbrillance entre trois et cinq zones exemptes de globules rouges et déterminez les valeurs de gris pour mesurer le signal de fond.
Pour effectuer une analyse alternative des données des images capturées, créez une commande macro via la version fidjienne d’ImageJ pour la sélection automatisée, la correction de l’arrière-plan et l’analyse des valeurs de gris d’une image donnée. Ouvrez l’image au format TIFF pour analyse aux Fidji. Ouvrez ensuite la fluorescence des globules rouges.
ijm , puis cliquez sur Exécuter. Le signal des anticorps ciblant l’oxyde nitrique synthase RB, ou NOS, phosphorylés au niveau du résidu de sérine 1177 au repos et en réponse à une exposition à la force mécanique a été évalué à l’aide de l’immunohistochimie et de l’immunofluorescence. Une multiplication par trois du signal des anticorps ciblant les globules rouges phosphorylés au niveau du résidu de sérine 1177 a été détectée en réponse à l’exposition à la force mécanique des globules rouges par rapport aux cellules non cisaillées respectives lors de l’évaluation par immunohistochimie ou immunofluorescence.
L’utilisateur doit s’assurer que l’anticorps n’est appliqué que sur la zone de test. Sinon, l’échantillon ne peut pas être analysé en raison d’un contrôle manquant. Compte tenu de la disponibilité d’une grande variété d’anticorps, il est possible de cibler de nombreuses protéines et processus de signalisation différents en utilisant cette méthode.
