Notre protocole nous permet de mesurer directement le métabolisme postprandial dans la lymphe mésentérique qui coule. Ceci est puissant parce que nous pouvons déterminer quantitativement le mouvement des nutriments de l’intestin grêle dans la lymphe. Et nous pouvons mesurer les cytokines, les lipides alimentaires, d’autres composants alimentaires et les lymphocytes.
Cette technique peut nous aider à disséquer la dynamique des lipides alimentaires se déplaçant dans la lymphe, la synthèse et la sécrétion des chylomicrons. Le modèle d’un jour présenté ici présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il réduit le temps expérimental.
Deuxièmement, il réduit le stress des animaux. Il augmente la survie des animaux. Et dans l’ensemble, diminue le nombre expérimental.
Notre technique sera présentée aujourd’hui par notre chirurgien de laboratoire principal, M. Nick Dedousis. et notre chercheur scientifique, le Dr Lihong Teng. Après avoir préparé la souris à la chirurgie, saisissez la peau avec une pince à épiler et faites une incision abdominale médiane avec de petits ciseaux.
Ensuite, coupez vers le sternum et vers le bas jusqu’à la graisse inguinale. À l’aide de l’écarteur, éloignez les viscères péritonéaux jusqu’à ce que le canal lymphatique soit visible. À l’aide d’un coton-tige imbibé de solution saline, déplacez le foie vers le côté supérieur droit du corps et les intestins et l’estomac vers la gauche de l’animal.
Ensuite, exposez l’artère mésentérique supérieure et le canal lymphatique intestinal en étirant le duodénum transversalement vers la gauche. Préparez un tube de canule de 30 à 40 centimètres de longueur en insérant une aiguille émoussée. Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre, rincer une petite quantité d’héparine dans le tube et couper un biseau à l’extrémité du tube de canule à l’aide de ciseaux.
Ensuite, faites une incision peu profonde et un canal lymphatique à l’aide de ciseaux à iris comme décrit dans le manuscrit. Tenez le tube de la canule avec une paire de pinces fines et insérez doucement le biseau de l’embout dans le conduit. Comme le canal lymphatique est fragile, utilisez une goutte de cyanoacrylate pour coller la canule lymphatique dans la lymphe mésentérique au lieu d’attacher le cathéter avec une suture.
Maintenant, à l’aide d’une aiguille de calibre 18, percez un trou dans la région pylorique de l’estomac postérieure au sphincter pylorique et insérez le tube de perfusion duodénale dans l’estomac un à deux millimètres au-delà du sphincter pylorique dans le duodénum. Ensuite, fixez le tube à l’estomac avec une ligature de corde de bourse à l’aide d’une suture en soie 5/0 et scellé avec une goutte de colle cyanoacrylate pour éviter les fuites. Commencez la perfusion intraduodénale de 5% de glucose et 0,9% de solution saline.
Remplacez les organes de la cavité corporelle et suturez l’incision médiane. Placez doucement la souris dans une contention de câlin. Fournir aux souris une perfusion intraduodénale continue de solution saline et de glucose pendant une heure.
Vérifiez le flux lymphatique de la canule et commencez à traire la canule lymphatique pour que la lymphe continue de circuler. Effectuer la perfusion lipidique classique d’un bolus d’émulsion lipidique de 0,3 millilitre via le tube de perfusion intraduodénal. Ensuite, remettez la perfusion à 5% de glucose et 0,9% de solution saline à 0,3 millilitre par heure en continu jusqu’à la fin de l’expérience.
Prélever les échantillons de lymphe et prépeser les tubes de microcentrifugation pendant 60 minutes et garder la lymphe sur la glace. Pesez les tubes la deuxième fois pour établir le poids de la lymphe sécrétée toutes les 60 minutes. Recueillir l’estomac, le caecum et le côlon et placer chaque organe dans un tube de verre de 15 millilitres.
Divisez l’intestin grêle en trois ou quatre segments. Coupez-le longitudinalement et recueillez le contenu luminal en rinçant le tissu avec deux à trois millilitres de PBS froid. Retirer la muqueuse intestinale comprenant les cellules épithéliales et la lamina propria associée de la couche musculaire en grattant chaque section dans deux à trois millilitres de PBS froid avec une pince à épiler incurvée.
Placez tous les tissus, les isolats luminaux et muqueux et la couche musculaire dans des tubes de verre. La concentration de triglycérides dans la lymphe a augmenté en réponse à un bolus intraduodénal de 300 microlitres de SMOFlipid. La concentration maximale de triglycérides est atteinte deux à trois heures après le bolus et diminue régulièrement pendant les six heures.
Le débit lymphatique augmente à partir de la perfusion de bolus zéro temps jusqu’à la fin de l’expérience. L’un des principaux objectifs de ce protocole était de réduire le stress des animaux, d’augmenter le taux de survie et de diminuer le temps d’anesthésie. Pour ce faire, nous avons remplacé les cages de retenue Bollman par des câlins et nous avons ajouté de l’humidité, de la chaleur et du réapprovisionnement en liquide.
Notre protocole d’une journée sur la fistule molle nous permet de mesurer en temps réel, in vivo, la dynamique d’absorption des lipides. Cela nous permet également d’étudier la diaphonie des organes intestinaux, le métabolisme, l’absorption des nutriments alimentaires et les phénotypes immunitaires.
