Le protocole est très sensible et permet une capture à haut débit du profil d’expression génique à une résolution unicellulaire. La technique fournit à la fois une spécificité spatiale et moléculaire anatomique à une résolution cellulaire unique. Après avoir récolté le cerveau, sélectionné les cellules individuelles et préparé l’ARNm, injectez le fluide de la ligne de contrôle dans la puce qPCR pour l’amorçage.
Insérez la puce qPCR dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script Prime et exécutez le programme. Une fois le programme terminé, retirez la puce qPCR amorcée et pipette six microlitres de la réaction de la plaque d’échantillon PCR dans le puits d’échantillon correspondant dans la puce qPCR amorcée.
Maintenant, pipeter six microlitres de la réaction de la plaque de dosage PCR dans le puits de dosage correspondant dans la puce qPCR amorcée. Insérez ensuite la puce dans le dispositif de mélange microfluidique. Sélectionnez le script Load Mix et exécutez le programme.
Allumez la plateforme microfluidique RT-qPCR et réchauffez l’ampoule. Retirez la puce qPCR du dispositif de mélange microfluidique et décollez l’autocollant de protection du bas de la puce. Ouvrez la plateforme microfluidique RT-qPCR et chargez la puce qPCR dans la plateforme.
Lancez le logiciel de collecte de données en cliquant sur Démarrer une nouvelle exécution. Vérifiez le code-barres et le type de puce de la puce. Cliquez ensuite sur suivant.
Sélectionnez le fichier d’exécution de la puce et parcourez l’emplacement du fichier pour le stockage de la collecte de données. Cliquez ensuite sur Type d’application et sélectionnez Expression génique. Sélectionnez ROX pour une référence passive, sonde unique et EVAGreen pour le type de sonde.
Cliquez pour sélectionner le programme de cyclage thermique et sélectionnez Biomark HD GE:Fast 96x96 PCR+Melt v2. PCL. Téléchargez le logiciel d’analyse de données.
Lancez le logiciel pour analyser l’expérience microfluidique RT-qPCR. Cliquez sur Chip Run et ouvrez le ChipRun. BML créé par l’expérimentateur.
Une fenêtre affichant les détails expérimentaux, y compris la référence passive, la sonde et le programme thermique PCR, apparaîtra. Sous l’onglet Chip Explorer, cliquez sur Sample Plate Setup (Configuration de la plaque d’échantillon) et créez un nouveau modèle d’échantillon de plaque. Copiez et collez les exemples d’étiquettes dans la feuille de calcul du logiciel selon la conception expérimentale.
Entrez le nom de l’échantillon et la concentration d’ARN utilisée pour les échantillons standard. Maintenant, mappez l’exemple configuré en cliquant sur mappage dans le menu des tâches et en sélectionnant SBS96-Left.dsp. Ensuite, sélectionnez Vues détaillées pour mettre à jour ces modifications dans le fichier et cliquez sur Analyser.
Sélectionnez Detector Plate Setup (Configuration de la plaque détectrice) et créez une nouvelle plaque d’essai. Sélectionnez le type et le format de conteneur appropriés. Collez les noms des tests selon la conception expérimentale et cliquez sur Analyser.
Dans le volet des paramètres d’analyse, cliquez sur Utilisateur et définissez l’ajustement sur auto. Maintenant, examinez manuellement chaque réaction dans la puce 96x96. Visualisez les courbes d’amplification et de fusion pour déterminer si chaque réaction a suivi le modèle qPCR attendu.
Si la courbe d’amplification ou de fusion ne correspond pas à ce qui est attendu, échouez cette réaction. Après QC, exportez les données en sélectionnant fichier, en cliquant sur Exporter et en enregistrant le jeu de données en tant que fichier csv. Comme le fichier csv exporté possède à la fois une matrice d’échec de réussite et une matrice avec des valeurs CT brutes, utilisez la matrice d’échec de réussite pour remplacer toutes les cellules défaillantes du jeu de données par NA. Téléchargez la version récente du logiciel open Source R, puis téléchargez l’application R Studio.
Pour le centrage médian, utilisez le logiciel R pour calculer la valeur CT médiane calculée à partir de toutes les valeurs CT pour un échantillon individuel, puis soustrayez toutes les valeurs CT individuelles de cette valeur médiane pour obtenir une valeur CT moins delta. Pour la normalisation des gènes d’entretien ménager, calculez l’expression moyenne des gènes d’entretien ménager pour chaque échantillon et utilisez cette valeur pour soustraire les valeurs CT individuelles. Pour générer une valeur CT delta moins delta, exécutez le code dans le logiciel R.
Téléchargez le jeu de données normalisé dans R et analysez les données à l’aide de la fonction d’échelle, générez les données mises à l’échelle, puis utilisez la fonction de carte thermique R ou un logiciel distinct pour générer une carte thermique. Pour organiser l’ensemble de données pour d’autres fonctionnalités, calculez les corrélations de Pearson entre chaque gène suivi de la fonction de fusion. Exportez et téléchargez ces données dans un logiciel de réseau de corrélation génétique.
Les neurones ont montré une expression élevée de NeuN et les échantillons microgliaux ont montré une expression significative des marqueurs microgliaux Cd34 et Cx3xr1. Les échantillons neuronaux Th + ont démontré une expression significativement élevée de Th par rapport aux échantillons de neurones Th et de microglies. Les neurones Th ont montré une expression significative de Gcg, suggérant que les échantillons de neurones Th sont enrichis avec des neurones qui utilisent Glp1 comme neurotransmetteur.
L’analyse linéaire de discrimination a montré que ces trois types de cellules avaient des profils d’expression génique différents pour les 65 gènes. Les sous-phénotypes cellulaires d’échantillons de neurones enrichis en Glp1 par le biais d’une série de temps de sevrage alcoolique ont été représentés à l’aide de cartes thermiques. Le sous-phénotype A, qui exprime fortement le groupe de gènes inflammatoires un, augmente en rapport au point de temps de retrait de huit heures et atteint un maximum à 32 heures de retrait.
Le sous-phénotype inflammatoire est normalisé pour contrôler par un retrait de 176 heures. Le sous-phénotype B, qui exprime fortement le deuxième groupe de gènes du récepteur GABA, démontre une suppression globale de l’expression de ce groupe de gènes par la condition de sevrage de 176 heures. L’expression génique des échantillons individuels a été combinée en moyennes afin que l’expression des grappes de gènes et l’emplacement des protéines de ce transcrit de gène puissent être visualisés tout au long de la série chronologique.
Cette technique peut être appliquée à n’importe quel système biologique ou tissu pour comprendre la réponse cellulaire à une maladie ou à une perturbation. Il s’agit de déchiffrer la réponse moléculaire à une résolution cellulaire unique relative à l’architecture spatiale et anatomique du tissu.
