Ce protocole permet de caractériser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale en utilisant le réseau de drosophiles comme système modèle. Le principal avantage de notre technique est qu’elle permet l’imagerie à haute résolution du trafic intracellulaire de protéines de la membrane basale à l’aide de protéines marquées de manière endogène et de la microscopie à super-résolution Airyscan. Bien que ce protocole soit développé pour imager le trafic intracellulaire de protéines de la membrane basale, il peut être étendu pour étudier le trafic d’autres protéines d’intérêt et d’autres systèmes biologiques, y compris la culture cellulaire et les organoïdes.
Pour commencer, après avoir disséqué les ovaires de la drosophile dans le PBS sous une lunette de dissection, ajoutez un millilitre de solution de fixation et fixez les ovaires sur une plate-forme de nutation pendant 15 minutes. Retirez la solution de fixation et effectuez deux lavages rapides, chacun avec un millilitre de PBST. En inversant doucement les tubes de microcentrifugation cinq à six fois, puis effectuez quatre longs lavages de 10 minutes chacun avec un millilitre de PBST sur une bascule à plate-forme de nutation.
Après avoir effectué la fixation et le lavage, retirez le PBST, puis ajoutez un millilitre de solution bloquante et bloquez les ovaires sur une bascule à plate-forme de nutation pendant au moins une heure. Ensuite, retirez la solution bloquante et ajoutez 300 microlitres de solution d’anticorps primaires, contenant des anticorps primaires dilués à leurs concentrations appropriées dans la solution bloquante. Incuber toute la nuit sur une bascule à plate-forme de nutation à 4 degrés Celsius.
Après avoir retiré la solution d’anticorps primaire, effectuez deux lavages rapides et quatre lavages longs, comme démontré précédemment, puis retirez le PBST et ajoutez 500 microlitres de solution d’anticorps secondaires contenant des anticorps secondaires fluorescents qui détecteront les anticorps primaires utilisés. Incuber les ovaires dans la solution d’anticorps secondaire sur une bascule à plate-forme de nutation pendant deux heures à température ambiante, puis effectuer deux lavages rapides et quatre lavages longs en PBST comme démontré précédemment sur une bascule de plate-forme de nutation. Après le dernier lavage, utilisez une pipette P-1000 pour pipeter doucement les ovaires de haut en bas dans le tube afin de séparer les chambres à œufs.
Laissez les chambres à œufs couler au fond en maintenant le tube en position verticale pendant cinq à 10 minutes. Ensuite, retirez le PBST à l’aide d’une pipette Pasteur, en laissant environ 50 microlitres. Ensuite, retirez autant que possible le PBST restant à l’aide d’une pipette P-200 et ajoutez deux gouttes de support de montage, suffisamment pour répartir uniformément sur un couvercle.
Pour faciliter le transfert du support de montage visqueux vers la glissière à partir du tube de microcentrifugation, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P-200. Ensuite, transférez lentement toutes les chambres à œufs du support de montage sur la lame de verre, en veillant à ne pas créer de bulles. Sous un microscope à dissection, étalez doucement le support de montage et séparez les chambres à œufs à l’aide d’une nouvelle pointe de pipette P-200 ou d’une pince pour couvrir une zone de la taille d’un glissement de couverture.
À l’aide d’une pince, placez soigneusement le couvercle sur les chambres à œufs en angle pour éviter les bulles et stockez la lame à température ambiante sur une surface plane dans l’obscurité pendant deux jours pour polymériser. Une fois le support de montage durci, la lame peut être stockée à 4 degrés Celsius dans l’obscurité pendant quelques semaines pour l’imagerie. Pour visualiser la localisation intracellulaire des protéines de la membrane basale, réglez l’objectif sur 63x et placez doucement une goutte d’huile d’immersion sur sa lentille, puis positionnez la glissière sur l’objectif avec le couvercle orienté vers l’objectif pour localiser l’échantillon.
Localisez la région d’intérêt à l’aide de l’oculaire du microscope épifluorescent, puis sélectionnez une configuration avec les paramètres appropriés pour les fluorophores à imager comme décrit dans le manuscrit. Une fois la configuration définie, imagez l’échantillon en sélectionnant Live sous Mode d’acquisition et ajustez le zoom entre 2 et 4x pour optimiser la zone de numérisation de l’échantillon. Pour chaque chaîne individuelle, sélectionnez une piste sous Chaîne et cliquez sur Live.
Ajustez le gain principal et la puissance laser lors de l’utilisation de l’outil indicateur de portée et suivez toutes les directives pour éviter les pixels saturés comme décrit dans le manuscrit, tout en répétant la même chose pour chaque canal. Dans la fenêtre bascule Mode d’acquisition, sous Taille de l’image, cliquez sur SR pour maximiser les capacités du détecteur et ajuster automatiquement la taille de l’image. Gardez la moyenne à Aucun en mode Airyscan car elle n’est généralement pas nécessaire et réduira le temps d’analyse.
Cependant, dans certains cas, une moyenne de 2x peut améliorer le rapport signal/bruit, puis cliquez sur Snap pour acquérir une image. Pour acquérir une pile Z, cochez la case Z-Stack sous l’onglet Acquisition. Ensuite, sélectionnez le canal souhaité pour observer le spécimen.
Par exemple, le canal DAPI et cliquez sur Live pour lancer une numérisation en direct, puis définissez une plage pour la pile Z à l’aide du bouton de réglage fin du microscope. Ensuite, définissez les points de terminaison de la pile Z en cliquant sur Définir en premier et Définir en dernier. Pour une reconstruction 3D optimale, définissez l’intervalle pour la pile Z inférieur à 0,5 micromètre pour attribuer la taille de l’étape et cliquez sur Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition de la pile Z.
Une fois les images ou la pile Z obtenues, cliquez sur l’option Traitement, puis sur Méthode et sélectionnez Traitement Airyscan. Effectuez un filtre automatique pour démarrer et, si nécessaire, effectuez un traitement manuel supplémentaire en modifiant la valeur de super résolution pour obtenir les meilleurs résultats pour l’échantillon. Une fois la valeur SR optimale déterminée, cliquez sur Appliquer pour générer une image traitée.
Dans le cas des images Z-stack, traitez soit comme une tranche Z, soit comme l’ensemble de la pile Z en cliquant sur la case Traitement 3D. Pour visualiser le trafic de protéines en 3D après l’acquisition d’une pile Z, générez une image 3D en cliquant sur l’icône 3D dans la fenêtre d’aperçu, qui apparaîtra dans la section de contrôle d’affichage de l’image traitée Airyscan. Parmi les différentes options de vue 3D, utilisez les vues Surface ou Mixte lors de l’affichage de la structure des vésicules.
Pour une image de la plus haute qualité, sélectionnez le paramètre Précis car le paramètre le plus rapide sera moins précis et entraînera un mauvais rendu 3D. Une fois l’image générée, manipulez l’image 3D en zoomant et en la faisant pivoter pour faire la mise au point sur un emplacement préféré. Une fois la vue obtenue, sous l’onglet 3D, sélectionnez Résolution affichée, puis cliquez sur Créer une image, qui créera un instantané de l’image dans la même orientation que celle affichée et pourra être enregistré et exporté dans différents formats de fichier.
La microscopie confocale peut être utilisée pour visualiser la localisation intracellulaire et le dépôt de protéines de la membrane basale telles que Viking-GFP lorsque les paramètres d’acquisition sont optimisés. Lorsque l’acquisition et le traitement de l’image sont effectués correctement, la microscopie à super-résolution augmente la résolution de l’image par rapport à la microscopie confocale. Comme l’illustrent les images mieux définies dans le trafic intracellulaire de protéines de la membrane basale, telles que Viking.
La projection orthogonale permet de visualiser la distribution globale des vésicules et des compartiments contenant des protéines de la membrane basale dans une seule image à l’aide d’une imagerie confocale ou à super-résolution. Une reconstruction 3D par assemblage d’une pile de sections optiques en Z prises par imagerie confocale ou à super-résolution a été utilisée pour évaluer la localisation et la distribution des protéines de la membrane basale intracellulaire. L’imagerie à super-résolution peut être utilisée pour déterminer la localisation précise des protéines de la membrane basale dans des conditions mutantes.
Par exemple, dans les cellules épithéliales de Crag knockdown, les protéines de la membrane basale s’accumulent à la fois par voie apicale et basale, ce qui indique qu’elles contrôlent la sécrétion polarisée des protéines de la membrane basale. La microscopie confocale et la microscopie à super-résolution peuvent également être utilisées dans des expériences de colocalisation. Par exemple, cette figure montre la colocalisation partielle de Viking-GFP et d’un marqueur de Golgi, GM-130, confirmant que Viking est trié dans le Golgi avant la sécrétion.
Pour imager efficacement le trafic de protéines de la membrane basale à l’aide de la microscopie à super-résolution, nous recommandons de monter soigneusement les ovaires et d’accorder une attention particulière lors du réglage des paramètres d’acquisition et de convolution. Ce protocole est optimisé pour visualiser le trafic intracellulaire et la sécrétion de protéines de la membrane basale. Cependant, il peut être facilement modifié pour imager efficacement le trafic d’autres protéines d’intérêt.
