Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

La méthode d’isolement de l’ADN proposée peut servir à étudier la dynamique du microbiote intestinal dans des modèles murins de maladies auto-immunes. Une méthode plus polyvalente, rentable et efficace est proposée pour obtenir de l’ADN à partir d’échantillons fécaux comparables aux trousses disponibles dans le commerce. Pour commencer, sortez chaque souris individuellement de sa cage, collectez une pastille fécale directement dans l’anus et conservez-la à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit traitée.

Traiter les échantillons avec des pinces, des tubes et des gants stériles et propres. Ajoutez une pastille congelée à un tube à vis pré-pesé de deux millilitres et notez le poids fécal en grammes, qui devrait se situer entre 0,02 et 0,05 gramme par granulé fécal. Ajouter à la pastille une fine couche de billes de verre de 0,1 millimètre, 500 microlitres de tampon de lyse et 200 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 20%.

Bead a battu le tube pendant quatre minutes dans un homogénéisateur, suivi de trois à cinq minutes de vortex. Centrifuger les tubes pendant une courte période pour éliminer les bulles et la mousse. Pour extraire l’ADN des échantillons de microbiote, transférer 350 microlitres de surnageant d’échantillon dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitres, sans aucun débris.

Ajouter 500 microlitres de phénol:chloroforme:alcool isoamylique, dans un rapport de 25:24:1, et vortex pendant une minute. Après centrifugation, transférer 180 microlitres de la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube à pression de 1,5 millilitre. Ajouter 180 microlitres de chloroforme, retourner et mélanger.

À partir de là, transférez 180 microlitres de la phase aqueuse dans un nouveau tube à pression. Dans une armoire de biosécurité, ajoutez 180 microlitres d’isopropanol froid et 36 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq molaires. Inversez-le plusieurs fois pour mélanger et placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes.

Jeter le surnageant, puis laver les granulés plusieurs fois avec 500 microlitres d’éthanol froid à 70%. Jeter le surnageant et sécher le tube à l’air sur du papier de soie à l’envers pendant 20 minutes, jusqu’à ce que la pastille devienne claire. Suspendre la pastille dans 50 microlitres d’eau de qualité moléculaire et chauffer le liquide à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes pour dissoudre complètement les grosses pastilles d’ADN.

Après chauffage, centrifuger ces tubes à 3 400 fois G pendant une minute pour récupérer les gouttelettes de condensation du couvercle. Mesurer la concentration et obtenir le rapport 260/280 à l’aide d’un spectrophotomètre. Un rapport pour un ADN de bonne qualité est généralement compris entre 1,8 et deux.

Centrifuger les échantillons préparés à 600 fois G pendant une minute à température ambiante, avant de les congeler à moins 80 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, envoyez 20 microlitres d’échantillons avec des concentrations allant de un à 50 nanogrammes par microlitre au laboratoire national d’Argonne pour le séquençage. La souche de souris dépourvue du récepteur CX3CR1 a une composition de microbiote intestinal différente de celle des souris LMR/lpr de type sauvage, MRL/lpr-CX3CR1 GFP/GFP, montre des différences significatives dans certains genres, pertinentes pour les bactéries potentiellement pathogènes telles que celles du phylum Proteobacteria.

Soyez prudent lorsque vous contaminez l’échantillon. Il doit être stérile. En outre, il est important de pipeter avec précision lors du transfert du surnageant dans un nouveau tube.

Cette méthode convient à l’analyse moléculaire telle que la PCR, la digestion enzymatique de restriction ou la construction de bibliothèques génomiques. Dans le lupus, nous avons prouvé une forte relation entre le microbiote intestinal et la progression du lupus.