Il s’agit d’un protocole simple et visualisé qui démontre la manipulation des organoïdes de l’adénocarcinome œsophagien dans deux processus de sous-culture différents avec et sans digestion unicellulaire. Le protocole normalisé pour la sous-culture des organoïdes EAC dans deux méthodes différentes peut aider les chercheurs à choisir les techniques appropriées pour différentes applications en aval dans leurs expériences basées sur l’AOP EAC. Lors de la gestion des PDO, il est essentiel de prêter attention aux détails à chaque étape.
Une POS basée sur l’équipe est cruciale pour la qualité des POD. L’un de nos doctorants Ning Bo Fan et Lisa Raatz, l’assistante technique du laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Préchauffer une plaque de 12 puits par incubation nocturne à 37 degrés Celsius en utilisant du dioxyde de carbone.
Si disponible, utilisez des puits vides à partir d’une plaque avec la culture organoïde dérivée du patient. Incuber un volume approprié de gel ECM pendant une heure sur de la glace pour la liquéfier. Placez la solution de récupération cellulaire sur la glace.
Retirez la plaque contenant des PDO en croissance de l’incubateur. Aspirer un vieux milieu à l’aide d’une pompe à vide. Ajouter 500 microlitres par dôme de solution de récupération de cellules glacées dans le puits.
Désintégraz le gel ECM en pipetant plusieurs fois pour fragmenter les dômes de gel ECM en petits morceaux à l’aide de 1 000 pointes de microlitres avec un large orifice. Combinez l’AOP, le gel ECM et la solution de récupération cellulaire d’un maximum de deux puits et transférez-la dans un tube à faible liaison de cinq millilitres. Incuber ce tube sur de la glace pendant 20 minutes.
Mélanger toutes les cinq minutes en inversant le tube. Centrifugez le tube à une vitesse de 500 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. S’il n’y a pas de pastille visible, retirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide jusqu’à ce que la phase contenant une solution DP APM en gel ECM soit atteinte et ajoutez trois millilitres de solution de récupération de cellules glacées.
Inverser le tube plusieurs fois et incuber sur de la glace pendant encore 10 minutes. Centrifuger à 500 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou d’une pipette de 1 000 microlitres.
Essayez d’enlever le surnageant autant que possible. Conservez la pastille d’AOP sur de la glace. Retirez les pointes pré-refroidies de 201 000 microlitres avec un large orifice du congélateur à moins 20 degrés Celsius et placez-les sur un banc propre.
Calculez 50 microlitres de gel ECM par dôme prévu pour l’ensemencement, plus 50 microlitres supplémentaires. Ensuite, remettez en suspension la pastille dans un gel ECM à l’aide d’une pointe pré-refroidie de 1 000 microlitres et mélangez en pipetant de haut en bas environ 10 fois. Retirez la plaque préchauffée de 12 puits de l’incubateur avant d’ensemencer les dômes.
Ensemencez les dômes contenant 50 microlitres de gel ECM dans la plaque chaude. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 20 à 30 minutes pour solidifier le gel ECM. Ajouter soigneusement le milieu AOP préchauffé sans déranger les dômes.
Surveillez les PDO ensemencés au microscope. Cultivez les AOP pendant 7 à 14 jours jusqu’à ce que la densité et la morphologie requises se produisent. Préparer le milieu de digestion en mélangeant deux millilitres de 0,25 % de trypsine EDTA et 20 microlitres de DNAase I pour digérer les AOP récoltés dans deux puits.
Remettre en suspension la pastille préalablement préparée dans un volume approprié de trypsine EDTA et de DNAase I préchauffés à 0,25 % et mélanger environ 10 fois en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres. Incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur rotatif avec une vitesse de rotation d’au moins 28 tr / min. Préparer un tube de 15 millilitres contenant six millilitres de solution d’inhibiteur de la trypsine de soja.
Après la digestion, mélangez soigneusement les PDO digérés plusieurs fois avec une pipette de 1 000 microlitres pour perturber les PDO. Transférer les AOP digérés dans le tube de 15 millilitres contenant une solution d’IDS pour arrêter la digestion. Centrifuger à 500 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide ou d’une pipette de 1 000 microlitres. Remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu basal. Déterminer la concentration et la viabilité des cellules à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
Calculez le nombre de cellules en fonction des dômes prévus pour l’ensemencement, plus un dôme supplémentaire, et transférez-les dans un tube frais de 1,5 millilitre à faible liaison. Centrifuger à 500 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres.
Ajouter un volume approprié de gel ECM à la pastille à l’aide d’une pointe d’orifice pré-refroidie de 1 000 microlitres de large. Mélanger en pipetant de haut en bas environ 10 fois. Ensemencez les AOP digérés dans une plaque de 12 puits, comme démontré précédemment.
Commencez le processus de cryoconservation des AOP non digérés avec des granulés préalablement préparés. Utilisez 500 microlitres de milieu de congélation à froid pour remettre en suspension la pastille de deux dômes et la transférer dans un flacon cryogénique. Congeler les AOP pendant la nuit au congélateur à l’aide d’un récipient de congélation cellulaire approprié.
Transférer les AOP congelés dans un congélateur de moins 150 degrés Celsius. Pour la cryoconservation des AOP digérés, transférez les cellules dans un tube frais de 1,5 millilitre à faible liaison. Centrifuger à 500 fois G pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres. Remettre en suspension la pastille dans un milieu de congélation de 500 microlitres et la transférer dans un flacon cryogénique. Congelez les AOP pendant la nuit dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius à l’aide d’un récipient de congélation de cellules approprié et transférez-les dans un congélateur de moins 150 degrés Celsius pour un stockage à long terme.
La sous-culture sans digestion unicellulaire prend moins de temps pour atteindre une densité comparable et conduit principalement à des structures compactes. En revanche, les PDO digérés à cellule unique montrent des structures avec un noyau creux. La figure montre la coloration à l’hématoxyline éosine et la coloration immunohistochimique des AOP EAC incorporés à la paraffine avec des structures compactes et creuses.
La pancytakératine permet l’identification des cellules tumorales épithéliales. La cytokératine 7 met en évidence les cellules tumorales différenciées glandulaires. La structure compacte existe principalement dans la culture non digérée, tandis que la structure creuse est dominante dans la culture qui a subi une digestion unicellulaire.
Le Ki67 met en évidence les populations cellulaires avec une prolifération cellulaire plus élevée. Le Ki67 en rouge et le PanCK en vert ont été répartis de la même manière entre le tissu primaire EAC, la structure compacte EAC PDO et la structure creuse EAC PDO. La figure montre les caractéristiques morphologiques des AOP EAC le premier jour de récupération à partir de stocks congelés avec cryoconservation à base de cellules uniques et cryoconservation à base d’AOP non digérée.
Nous vous recommandons de faire un plan de sous-culture clair à l’avance. Le contrôle de la température et le pipetage en douceur sont essentiels pour la manipulation correcte des gels ECM lors de la sous-culture des PDO. Notre protocole fournit aux chercheurs les éléments nécessaires pour maintenir leurs AOP EAC en fonction de leur objectif d’étude pour l’analyse en aval telle que le test de dépistage de médicaments, la cytométrie en flux ou l’analyse histologique.
Nous espérons que nos travaux pourront aider les chercheurs en organoïdes à prendre des décisions rapides et faciles pour le stockage et la sous-culture des organoïdes, en particulier pour des résultats robustes de matériaux dérivés de patients dans la recherche translationnelle.
