Ce protocole présente un aperçu des proliférations d’algues et de la façon de surveiller efficacement les espèces d’algues toxiques. La procédure aide à fournir une alerte précoce des proliférations d’algues pour protéger la communauté contre les dommages associés. L’analyse par métabarcodage peut détecter de nombreuses espèces dans un échantillon à la fois, mais elle nécessite des procédures compliquées.
Ce protocole explique visuellement chaque étape pour aider à minimiser les erreurs humaines lors de l’analyse. Les procédures de microscopie seront démontrées par Henry Cameron de l’Université Antofagasta, la collecte d’échantillons par Jonathan Vilugron de l’Instituto de Fomento Pesquero, le prétraitement d’échantillons par Karen Vergara de l’Université Los Lagos et l’analyse de métabarcodage par Ignacio Rilling et Marco Campos de l’Université La Frontera. Commencez par prélever trois litres d’échantillon d’eau à partir d’un endroit cible.
Filtrez un litre d’eau pour l’analyse de l’ARNr 16S grâce à une filtration en tandem pour séparer les bactéries libres vivantes et attachées. Ensuite, filtrez un autre litre d’eau pour l’analyse de l’ARNr 18S à travers une seule filtration avec une membrane de 0,2 micron. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, coupez la membrane filtrée en deux, enveloppez une moitié avec du papier d’aluminium pour le stockage et, avec l’autre moitié, procédez à l’extraction de l’ADN avec la méthode Chelex.
Pour l’analyse microscopique, transférer un millilitre de l’échantillon d’eau sur une lame de grille d’un millilitre à l’aide d’une pipette. Observez l’échantillon au microscope et enregistrez les noms et la quantité des espèces de phytoplancton. Nettoyez les pipettes dans l’armoire à hotte laminaire avec de l’éthanol à 70%, puis l’exposition aux UV pendant 30 minutes.
Pour la première génération d’amplicons PCR, aliquote 22,5 microlitres du mélange maître dans une bande de huit tubes suivie de 2,5 microlitres de l’échantillon d’ADN, puis exécutez le premier cycle pcR. Ensuite, préparez 100 millilitres d’un gel TBE à 2% d’agarose contenant 10 microlitres d’une tache de gel d’acide nucléique. Une fois le gel prêt, chargez un mélange contenant 1,5 microlitre d’un colorant à chargement d’ADN et quatre microlitres du produit PCR et effectuez une électrophorèse à 100 volts pendant 30 minutes.
Ensuite, imagez le gel sous la lumière UV et confirmez la présence d’une bande de paire de base de 500 à 600. Les amplicons manquants peuvent parfois être résolus en diluant l’échantillon à 1 000 fois avec de l’eau. Ensuite, utilisez un système de nettoyage de l’ADN à base de billes magnétiques pour nettoyer les premiers produits de PCR, puis transférez 20 microlitres de chaque premier produit de PCR nettoyé vers une nouvelle plaque de 96 puits et scellez la plaque avec un film de microscelle.
Conservez la plaque à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’étape suivante. Pour l’indexation par deuxième PCR, après avoir dilué tous les amorces d’indice un et d’index deux à une concentration micromolaire avec de l’eau de qualité PCR dans huit bandelettes de PCR tubulaires, placez les amorces d’indice un dans une rangée horizontale et indexez deux amorces dans une rangée verticale. Ensuite, en utilisant une pipette multicanal à 2,5 microlitres d’indice un apprêt à chaque puits d’une nouvelle plaque de 96 puits.
Ensuite, ajoutez 12,5 microlitres d’une formulation prête à démarrer à chaud à chaque puits. Ensuite, ajoutez 2,5 microlitres d’amorce d’indice deux et 7,5 microlitres du premier produit PCR purifié à chaque puits. Après avoir mélangé en pipetant de haut en bas 10 fois, couvrez la plaque avec un film Microseal et exécutez le deuxième cycle de PCR.
Une fois la PCR terminée, placez la bande d’écran ADN dans un analyseur de fragments. Mélanger deux microlitres de tampon d’échantillon dans trois microlitres du deuxième amplicon PCR dans huit nouvelles bandes de tubes et insérer les bandes dans l’analyseur de fragments pour commencer l’analyse. Assurez-vous que les deuxièmes amplicons PCR sont d’environ 613 paires de bases pour les gènes de l’ARNr 16S et 18S.
Purifiez les deuxièmes produits de PCR à l’aide d’un système de nettoyage de l’ADN des billes magnétiques, comme démontré précédemment. Ensuite, mesurez leur concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre de quantification des acides nucléiques. Dans une nouvelle plaque de 200 microlitres de 96 puits, diluer chaque deuxième produit PCR purifié avec de l’eau PCR stérile à quatre nanomoles.
À l’étape suivante, le protocole doit être exécuté sans arrêt. Aliquote trois microlitres de chaque deuxième produit DE PCR dilué dans un nouveau tube stérile de 1,5 millilitre pour créer une bibliothèque groupée. Gardez toujours le tube à quatre degrés Celsius.
Un jour avant le séquençage, retirez une cartouche de réactif prête à l’emploi préremplie de moins 20 degrés Celsius et placez-la à quatre degrés Celsius pour la décongélation. Le jour du séquençage, réglez un bloc thermique adapté aux tubes centrifuges de 1,5 millilitre à 96 degrés Celsius et placez le tampon d’hybridation sur la glace. Ensuite, diluez l’hydroxyde de sodium de qualité moléculaire avec de l’eau et diluez une bibliothèque de contrôle prête à l’emploi avec un tampon TE.
Mélangez 16 microlitres des quatre nanomoles ou de la bibliothèque d’échantillons regroupés avec quatre microlitres de la bibliothèque de contrôle dans un nouveau tube étiqueté comme un seul. Ensuite, mélangez 10 microlitres de l’échantillon du premier tube avec 10 microlitres d’hydroxyde de sodium dans un nouveau tube étiqueté comme deux. Après un vortex et un bref tour, incuber le tube deux à température ambiante pendant cinq minutes, puis ajouter 980 microlitres de tampon d’hybridation.
Ensuite, dans un nouveau tube étiqueté comme trois, mélangez 260 microlitres de l’échantillon du tube deux avec 390 microlitres de tampon d’hybridation. Après avoir mélangé le contenu en inversant le tube, incubez-le à 96 degrés Celsius pendant deux minutes, puis incubation sur glace pendant deux minutes. Ensuite, retirez la cartouche du réfrigérateur et configurez la feuille d’échantillon pour le séquençage avec chaque adaptateur d’index un et d’index deux correspondants.
Après avoir retiré la cellule d’écoulement du kit MiSeq V3, nettoyez doucement la cellule d’écoulement avec de l’eau PCR stérile de qualité moléculaire. Chargez tout le volume du tube trois dans la cartouche. Ensuite, dans le logiciel de fonctionnement de l’instrument, sélectionnez séquençage et suivez les instructions pour insérer la cellule d’écoulement, le tampon d’incorporation et la cartouche.
Enfin, chargez la feuille d’exemple et appuyez sur Exécuter pour démarrer la réaction. Cette exécution de séquence prend de trois à cinq jours. L’analyse du métacodage à barres de l’ARNr 18S pour identifier les espèces d’algues présentes dans l’eau de mer recueillie à Metri Puerto Montt, au Chili, le 19 février 2019, a donné 13 750 lectures, avec plus de 30 espèces d’algues.
L’espèce Navicula était l’algo dominant avec une abondance relative de 70,73% En outre, une abondance suffisante a été observée pour les espèces Micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella et Prorocentrum. L’espèce Pseudochattonella, l’une des principales causes des proliférations d’algues nuisibles chiliennes, a une abondance de 0,52%. Conformément à l’analyse du gène de l’ARNr 18S, l’observation microscopique a montré que Navicula était l’espèce dominante et que Prorocentrum était une espèce mineure.
Les 12,6% de petites cellules de phytoplancton non identifiables enregistrées par microscopie pourraient être des Micromonas, selon les résultats de l’ARNr 18S. L’analyse du métacodage à barres de l’ARNr 16S pour identifier les espèces bactériennes dans le même échantillon d’eau a montré 31 758 lectures avec plus de 30 espèces bactériennes. L’espèce bactérienne vivante libre dominante était Amylibacter, avec une abondance relative de 20,02%, suivie de Cladella à 13,53% et Algiphilus à 7,06%L’abondance relative de deux espèces d’algues toxiques, Alexandrium et Pseudochattonella, est tracée dans le temps pour trouver un modèle de croissance unique.
L’abondance relative de tous les genres bactériens dans les ordres détectés dans l’eau de mer sur cinq mois est tracée et le temps est nécessaire pour analyser le changement de population de certains organismes. Il est crucial d’être très propre. La contamination de l’échantillon doit être évitée à l’aide d’une lingette à l’alcool, d’une lumière UV ou de l’autoclavage du matériau.
Les solutions diluées ne doivent pas être réutilisées et les tubes doivent toujours être bouchés. La détection des algues par métacodage à barres doit être associée à la microscopie. L’espèce dominante peut être confirmée par microscopie garantissant qu’aucune erreur humaine n’est commise lors des processus de méta-codage à barres.
Les proliférations d’algues nuisibles endommagent l’écosystème marin et l’économie côtière. Au Chili, les proliférations d’algues tuent les saumons d’élevage, endommageant les aguacultures. Cette analyse de méta-codage à barres augmentera l’efficacité des avertissements de prolifération au Chili.
