La mesure de la fréquence cardiaque intrinsèque est un indicateur important de la santé cardiaque. Cette technique mesure avec précision ce taux tout en excluant la majorité des influences confondantes sur le nœud sino-auriculaire. L’enregistrement MEA de la fréquence cardiaque intrinsèque capture des données de cadence de tir précises similaires aux enregistrements à cellule unique sans formation approfondie en électrophysiologie.
Les personnes utilisant cette technique peuvent avoir du mal à obtenir des préparations de tissus sains dans les premières expériences, alors pratiquez la dissection et optimisez les tampons et les paramètres de collecte de données avant de commencer la collecte de données réelles. Les docteurs Man Si et Praveen Kumar, chercheurs post-doctoraux dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Commencez par tenir la peau de la souris euthanasiée avec un hémostat et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision transversale dans la peau juste sous le bas de la cage thoracique de l’arc costal gauche à l’arc costal droit.
Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir le péritoine et séparez soigneusement le foie du diaphragme sans entailler le foie pour éviter les saignements excessifs. Inciser le diaphragme le long du thorax pour exposer la cavité thoracique. Utilisez les ciseaux chirurgicaux pour couper les parois latérales de la cage thoracique des bords des arcs costaux jusqu’aux clavicules pour exposer le cœur, puis utilisez une aiguille de seringue de calibre 23 pour épingler la cage thoracique sur l’épaule.
Utilisez une pipette de transfert pour déposer la solution complète héparinisée chaude de Tyrode sur le cœur afin de le garder humide. Tenez les poumons avec une pince Graefe extra fine et coupez la trachée avec des ciseaux chirurgicaux pour enlever les poumons. Pour enlever le cœur, tenez l’apex du cœur avec une pince Graefe extra fine et coupez l’aorte et la veine cave inférieure avec des ciseaux chirurgicaux.
Transférer le cœur dans une boîte de Petri contenant de l’élastomère de silicone durci et utiliser une pipette de transfert pour baigner le cœur avec deux à trois millilitres de solution complète de Tyrode héparinisée chaude. Attachez l’apex du cœur au plat avec une épingle à dissection. Tenez la veine cave inférieure avec les pinces à laminectomie Dumont 2.
Insérez une aiguille de seringue de calibre 22 à travers la veine cave inférieure et supérieure pour localiser leur position dans l’oreillette droite, ce qui identifie également la position approximative du nœud sino-auriculaire. Tenez l’appendice auriculaire droit avec les pinces à laminectomie Dumont 2 et placez une broche de dissection à travers l’appendice auriculaire droit pour le maintenir en place. Répétez la même procédure pour l’appendice auriculaire gauche, puis retirez l’aiguille de la seringue qui s’étend sur la veine cave.
Utilisez des ciseaux Castroviejo pour enlever l’apex du cœur en faisant une incision transversale à travers les ventricules pour libérer le sang du cœur, puis lavez le cœur en ajoutant une solution complète de Tyrode héparinisée chaude. Utilisez des ciseaux Castroviejo pour couper le long du septum auriculo-ventriculaire jusqu’à ce que les oreillettes soient séparées des ventricules et gardez l’incision plus près du ventricule. Couper le long du septum interartériel pour enlever l’oreillette gauche.
Placez les broches de dissection à la périphérie de l’atrium droit pour le rendre à plat. Retirez toute graisse, tout vaisseau ou tout tissu restant de l’oreillette à l’aide des ciseaux Castroviejo et localisez le nœud sino-auriculaire dans l’oreillette droite. Ajoutez la solution de Tyrode au modèle de solution d’entrée et activez le flux de gaz carbogène pour oxygéner la solution de Tyrode.
Réglez la pompe péristaltique à 25 tr / min, ce qui donne un débit de deux millilitres par minute. Après avoir démarré la pompe, assurez-vous que le tampon ne fuit pas du système et réglez le régulateur de température à 37 degrés Celsius. Utilisez des pinces Dumont 55 pour transférer le tissu disséqué de la boîte de Petri disséquante sur la grille du réseau de microélectrodes.
Positionnez doucement le tissu avec un pinceau doux pour superposer la région du nœud sino-auriculaire de la grille d’électrodes. Placez ensuite la maille sur le tissu à l’aide de la pince osseuse ou de toute pince incurvée. À l’aide de la pince à os, positionnez l’ancre de la harpe sur le maillage pour maintenir tout en place.
Disposez la parabole à microélectrodes sur la plaque de connexion. Placez soigneusement le capuchon de perfusion sur la boîte à microélectrodes sans perturber l’ancrage de la tranche de harpe et fixez l’espace de perfusion avec du ruban adhésif. Allumez l’amplificateur et configurez un flux de travail pour l’enregistrement dans le logiciel.
Sélectionnez beat_recording. Modèle moflo. Ouvrez-le et définissez le nombre de traces, la durée de la trace, l’intervalle de trace, la tension d’entrée, la fréquence d’échantillonnage et d’autres paramètres d’enregistrement en fonction des conditions d’enregistrement souhaitées.
Cliquez sur le bouton d’enregistrement et de lecture pour démarrer l’enregistrement et acquérir des données pour 10 traces d’une durée d’une minute avec deux minutes d’intervalles entre les traces. Mettez la pompe en pause et basculez le tuyau d’entrée de la pompe de la solution d’enregistrement normale vers la solution de Tyrode contenant le médicament souhaité de votre choix. Redémarrez la pompe et reprenez l’enregistrement.
Une fois que la solution de Tyrode perfusée par le médicament a atteint le tissu, enregistrez 10 traces de la même manière que précédemment pour les enregistrements de base. Prenez une photo finale du positionnement du tissu sur le réseau de microélectrodes. Ouvrez le fichier de données enregistré enregistré dans le modèle d’analyse de fréquence de battement du logiciel d’analyse.
Cliquez sur la lecture et laissez l’ensemble de l’enregistrement s’exécuter pour la visualisation des données, puis attribuez les paramètres d’analyse appropriés. Sélectionnez les canaux à inclure dans l’analyse et définissez les maxima d’amplitude ou les valeurs seuils d’amplitude minimale souhaités pour l’identification automatisée des pics de forme d’onde. Cliquez à nouveau sur l’icône de lecture pour réexécuter le jeu de données et confirmer que les paramètres d’analyse sont appropriés pour une extraction de pic.
Aux fins de l’analyse, identifiez les trois traces consécutives les plus stables qui présentent un taux de battement stable pour chaque trace dans la plupart des canaux au cours de la période de référence de l’expérience et trois autres traces stables consécutives pendant la période d’exposition au médicament. Cliquez sur l’icône de lecture et d’enregistrement pour lancer l’analyse. Les données ont été recueillies auprès d’une souris suisse noire mâle de type sauvage âgée de 45 jours pour la mesure de la fréquence des battements de nœuds sino-auriculaires.
Les formes d’onde de formes et d’amplitudes différentes ont été observées dans différents canaux et tous les canaux ont montré des intervalles d’interspike et des fréquences de tir identiques. Cependant, le degré de contact tissulaire avec l’électrode peut également influencer les caractéristiques de la forme d’onde telles que l’amplitude. Parmi les 10 traces enregistrées, les trois canaux consécutifs avec une fréquence de battement stable et un intervalle interspike ont été choisis pour une analyse plus approfondie.
Les modèles de pointes mal extraits doivent être absents, mais s’ils sont présents, ils sont influencés par le bruit ou instables. Les formes d’onde qui correspondent aux battements cardiaques individuels reflètent l’activité cardiaque intrinsèque de la prise de rythme cardiaque. Le système de réseau de microélectrodes permet une application facile des agents médicamenteux pour analyser les effets pharmacologiques.
La vitesse de tir intrinsèque de trois traces sélectionnées sur les 64 canaux s’est avérée être d’environ 320 battements par minute dans les données d’échantillonnage. L’introduction de la 4-aminopyrimidine a augmenté les intervalles interspike comme prévu, ce qui a réduit la fréquence des battements de 320 à 210 battements par minute. Pour recueillir des données fiables à des fins d’analyse, il est important de confirmer que les tissus sont sains pendant l’enregistrement en vérifiant que les traces sont stables et répondent aux critères standard.
Les AME peuvent être utilisés pour enregistrer l’activité cardiaque dans d’autres régions du cœur, ce qui permet une caractérisation détaillée spécifique à la région qui se prête à l’étude des effets de la manipulation génétique et pharmacologique.
