L’objectif global de ce protocole est le criblage d’expression de la construction multiple des methyltransferases d’arginine de protéine dans la production à grande échelle pour obtenir la quantité de milligramme de la protéine pour des études biochimiques, biophysiques, et structurales dans le mode moyen supporté et rentable dans la couverture de la plate-forme d’expression S, système vectoriel d’expression de baculovirus. La Dre Alma Seitova présentera les étapes suivantes. Diluer les cellules SF9 à croissance exponentielle à la densité cellulaire finale de 0,4 million par mil dans le milieu d’insecte sans sérum, et verser dans le réservoir de réactif stérile.
Utilisez une pipette multicanal programmable pour ensemencer 0,5 mils de cellules SF9 diluées dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Ce volume est suffisant pour assurer une couverture uniforme de la surface de travail du puits. Dans le même temps, il ne dilue pas trop le mélange de transfection, ce qui permet une efficacité de transfection.
Étiquetez un puits de la plaque comme cellule seulement, et utilisez-le comme contrôle pour la comparaison de la cellule transfectée et non transfectée afin d’évaluer les signes potentiels d’infection. Incuber les plaques à 27 degrés jusqu’à ce que nécessaire, environ une heure, pour laisser les cellules se fixer aux plaques de culture cellulaire. Diluer le réactif de transfection bien mélangé dans le milieu d’insecte non complété et un réservoir de réactif stérile, et mélanger doucement pendant 10 secondes.
À l’aide d’une pipette à 12 canaux, transférer 102 microlitres du réactif de transaction dilué dans une plaque stérile 96 MicroWell. Transférer 10 microlitres de 0,2 microgramme par microlitre d’ADN bacmid recombinant dans le puits correspondant de la plaque MicroWell de 96 puits et mélanger en secouant doucement, en tapotant la plaque sur les côtés. Incuber le mélange de transfection pendant 15 à 20 minutes pour une formation complexe.
À l’aide d’une pipette réglable à six canaux conçue pour le transfert entre une plaque de 96 et 24 puits, superposez le mélange de transfection sur les cellules en goutte d’eau dans les puits correspondants des plaques de transfection et incuber pendant quatre heures à 27 degrés. Pour assurer une distribution uniforme du mélange de transfection sur la monocouche des cellules, basculez doucement les plaques d’avant en arrière plusieurs fois pendant le temps d’incubation. Quatre à cinq heures après le temps de transfection, ajoutez 1,5 mils de milieux d’insectes sans sérum.
Complétez-le avec 10% final de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1% antibiotique et antimycotique. Incuber des cellules dans un incubateur à 27 degrés pendant 72 à 96 heures. Basculez doucement les plaques de transfection une fois par jour lorsque cela est possible.
Recherchez les signes d’infection évidents dans les cellules transfectées entre 72 et 96 heures après la transfection. Quatre à cinq jours après la transfection, les signes de l’infection devraient être évidents dans les cellules transfectées en comparaison avec les cellules de contrôle sous un microscope inversé, et les baculovirus recombinants initiaux sécrétés dans le milieu de culture cellulaire devraient être prêts à recueillir. Utilisez un multicanal électronique programmable pour permettre simultanément la collecte des virus P1, l’infection des cellules SF9 fraîchement ensemencées dans l’infection des cellules de suspension dans leurs 24 blocs de puits avec 150 microlitres des virus P1.
Faites tourner le reste des stocks viraux P1 collectifs pendant 15 minutes, couvrez les 24 blocs de puits avec une culture en suspension des cellules SF9 infectées avec une feuille AirPore. Incuber le bloc de 24 puits à 27 degrés avec des secousses à 245 RPM pendant 72 à 96 heures. Quatre jours avant le temps de production prévu, diviser les cellules SF9 à croissance exponentielle, à une densité cellulaire finale de 2 millions par mil en soie dentaire de verre Erlenmeyer shake avec des chicanes dans des milieux d’insectes sans sérum contenant 1% d’antibiotique final et d’antimycotique.
Cette étape générera une culture en suspension de cellules d’insectes infectées et de virus P2 dans le surnageant pour l’infection de nouvelles cellules dans le lot de production. Ajoutez les virus P2 correspondants et incuber les cellules infectées à la température inférieure de 25 degrés pour ralentir la croissance cellulaire, en secouant à 165 RPM sur un agitateur orbital avec un trait d’un pouce. Quatre jours avant le temps de production prévu, ensemencez deux litres de cellules SF9 à croissance exponentielle dans des milieux sans sérum d’insectes à la densité cellulaire de 1 million par mil, dans le flacon de secouer Fernbach de 2,8 litres.
Agiter le ballon à 27 degrés en secouant à 150 RPM. Le chercheur Ashley Hutchinson démontrera le protocole suivant. Diviser quatre litres de cellules SF9 à croissance exponentielle et de milieux sans sérum d’insectes à la densité cellulaire finale de 4 millions par mil dans les grandes bouteilles de réactifs de cinq litres.
Ajouter 10 à 12 mils de la culture en suspension des cellules d’insectes infectées par le baculovirus. Incuber la culture infectée des cellules SF9 dans un agitateur secouant 145 RPM à une température inférieure de 25 degrés Celsius pendant 72 à 96 heures. Des quantités de milligramme de plusieurs protéines recombinantes de la famille PRMT expriment dans la production immédiate de baculovirus dans les cellules SF9 sont utilisées pour des études pédagogiques biophysiques biochimiques, comme on peut le voir dans la figure cinq.
Au SGC, les structures cristallines ont été résolues dans déposées dans la banque de données de protéines pour les formes pleine longueur ou tronquées des protéines PRMT4, 6, 7 et 9 avec diverses sondes chimiques et inhibiteurs. Les plasmides d’expression de ces PRT ont été déposés pour ajouter la collecte de gènes par SGC et sont disponibles pour le milieu de la recherche. Dans cette vidéo, nous avons souligné les éléments clés pour le criblage réussi d’expédition de leur construction multiple des methyltransferases d’arginine de protéine dans la production à grande échelle dans le système d’expression de baculovirus.
L’utilisation des pipettes multicanaux réglables et programmables régulières a rendu l’ensemble de leur processus plus rapide qu’efficace. L’utilisation de haute performance et moins toxique cellulaire pour les cellules, réactif de transfection pour la génération de virus recombinants a conduit à plus rentable et ce protocole de transfection de manipulation cellulaire. L’infection du lot à grande échelle pour la production de protéines avec la culture en suspension du baculovirus infecté dans six cellules a réduit de manière significative les travaux dans l’étape de temps de temps dans l’amplification vitale de démarrage.
Est par exemple, centrifuger cela avec une culture spéciale de cellules infectées. C’est bien sûr exclu la manipulation supplémentaire des cellules infectées dans éviter dans leur plus serré dans la dégradation du virus. Suspension culture culture cellule maintenance dans cette mise à l’échelle de la production dans le récipient de culture était un volume de champ élevé nous aider à surmonter la limitation du volume de production et d’adopter une plate-forme à grande échelle.
Ceci est très utile pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux bioréacteurs ou dont l’espace dans le pipeline de production est limité. Bien que notre protocole ait été décrit pour les protéines de la famille de methyltransferases d’arginine de protéine, la même approche peut être appliquée à n’importe quelle autre famille de protéines exigeant la plate-forme d’expression d’obtenir une quantité suffisante de leur protéine pour des études pédagogiques biophysiques biochimiques.
