Cette méthode permet de répondre à l’une des questions les plus importantes concernant les vaccins SARS-coronavirus-2 en cours de développement. Le vaccin est-il capable de provoquer une réponse d’anticorps neutralisants? Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être effectuée dans une installation de niveau de confinement deux.
Il est également relativement rapide et peu coûteux, ce qui le rend bien adapté à l’analyse de plusieurs échantillons à la fois. Pour démontrer la procédure de neutralisation de l’acide, nous avons Ricardo Marius, un technicien principal dans le laboratoire et Taylor Jamieson, un étudiant au doctorat en médecine. Commencez par cultiver des cellules Vero E6 dans du DMEM complété par 10% FBS à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Pour passer les cellules, lavez-les d’abord en ajoutant 10 millilitres de PBS et en berçant doucement le plat quatre à cinq fois. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez trois millilitres de trypsine EDTA et secouez le plat pour vous assurer que toute la surface est recouverte avant de l’incuber à 37 degrés Celsius. Une fois les cellules détachées, désactivez la trypsine en ajoutant sept millilitres de DMEM complétés par 10% FBS, puis resuspendez les cellules en pipetant plusieurs fois.
Retirer la trypsine par centrifugation et aspirer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire avant de réutiliser les cellules dans 10 millilitres de DMEM frais. Après le comptage, ajoutez environ une fois 10 à la septième cellule à chaque plaque de 15 centimètres et incubez la culture pendant un à deux jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 100%. Pour préparer le pseudovirus VSV spike EGFP pour le titrage, infecter les cellules à 0,01 multiplicité d’infection avec le virus stock dilué dans 12 millilitres de DMEM sans sérum.
Après avoir ajouté le virus, incuber les cellules pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec des balancements occasionnels. À la fin de l’incubation, remplacez l’inoculum par du DMEM frais complété par 2% de FBS et des tas de 20 millimolaires, puis incubez les cellules à 34 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, utilisez un microscope fluorescent pour visualiser l’expression EGFP des cellules infectées.
Une fois qu’un effet cytopathique étendu et un décollement cellulaire sont observés, collectez le surnageant de culture et éliminez les débris par centrifugation. Pour éviter de multiples cycles de gel-dégel, aliquotez le surnageant avant le stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour déterminer le titre viral, plaquez les cellules Vero E6 dans six plaques de puits à une densité d’ensemencement de six fois 10 à la cinquième cellule par puits et incubez pendant la nuit.
Le lendemain, mettez en place une série de dilution en série décuplée du stock viral en ajoutant 900 microlitres de milieu à sept tubes de microcentrifugation et en ajoutant 100 microlitres de stock viral au premier tube. Après un bref vortex, transférer 100 microlitres de virus dilué dans chaque tube suivant, en vortexant entre chaque tube. Remplacez ensuite le surnageant dans chaque puits de la plaque de culture Vero E6 par 500 microlitres des dilutions virales 10 à moins seconde à 10 à moins septième.
Après une incubation de 45 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire avec un balancement doux toutes les 15 minutes, remplacez l’inoculum par une solution de superposition et incubez les cellules à 34 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. À la fin de l’incubation, pour visualiser les plaques par coloration violette cristalline, lavez les cellules une fois avec du PBS avant d’ajouter deux millilitres de violet cristallin à 0,1% à chaque puits. Placez la plaque sur une bascule pendant environ 20 minutes à température ambiante avant de laver doucement chaque puits deux fois avec du PBS.
Après le dernier lavage, laisser sécher les plaques à l’air libre pendant au moins une heure avant d’utiliser la formule indiquée pour calculer le titre du virus dans chaque puits en unités formant de la plaque par millilitre. Pour plaquer les cellules pour un test de neutralisation, utilisez une pipette multicanal pour ajouter 100 microlitres de cellules Vero E6 à chaque puits d’une plaque de 96 puits à une densité de deux fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, et incubez la plaque pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, la chaleur inactive les échantillons de sérum du patient à tester dans un bain-marie à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, mettez en place une série de dilution décuplée des échantillons de sérum du patient dans une plaque de culture tissulaire vide de 96 puits en ajoutant huit microlitres de sérum à 72 microlitres de DMEM sans sérum avec des antibiotiques dans chaque puits de la rangée A.Ajoutez ensuite 40 microlitres de DMEM sans sérum à chaque puits des rangées B à G et 80 microlitres à chaque puits de la rangée H.À l’aide d’une pipette multicanal à 12 puits, mélanger les échantillons de la rangée A, puis transférer 40 microlitres de l’échantillon de chaque puits de la rangée A à chaque puits de la rangée B.Après le mélange, répéter la dilution pour chaque rangée de puits suivante jusqu’à la rangée F.Ensuite, ajouter 40 microlitres d’EGFP à 0,05 multiplicité d’infection à chaque puits des rangées A à G, et mélanger en pipetant quatre à cinq fois avant d’incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, aspirer soigneusement le surnageant de chaque puits de la plaque de culture Vero E6 et transférer 60 microlitres de mélange de virus d’anticorps de chaque puits de la plaque de dilution de l’échantillon au puits correspondant de la plaque de culture cellulaire. Lorsque tous les échantillons ont été transférés, placez la plaque de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant une heure avec un balancement toutes les 20 minutes.
Une fois l’incubation terminée, ajoutez 140 microlitres de solution de superposition de carboxyméthylcellulose à chaque puits de la plaque de culture cellulaire et transférez la plaque dans un incubateur à 34 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après 24 heures, imagez les plaques sur un imageur fluorescent automatisé à une longueur d’onde de 488 nanomètres et utilisez la fonction de comptage automatisé de l’imageur pour quantifier les foyers EGFP individuels. Dans cet exemple représentatif, un anticorps neutralisant disponible dans le commerce contre le domaine de liaison du récepteur de pointe du SRAS-coronavirus-2 a été utilisé comme témoin positif, aux côtés des IgG comme témoin négatif.
Le pourcentage d’inhibition a été calculé en fonction du nombre de foyers EGFP détectés par imagerie fluorescente. La neutralisation du pseudovirus par des échantillons de patients convalescents prélevés environ trois mois après l’infection par le SRAS-coronavirus-2 a montré que les patients hospitalisés présentaient une capacité de neutralisation accrue par rapport à ceux qui n’avaient pas besoin d’hospitalisation. Cette procédure peut également être utilisée pour évaluer d’autres agents de prévention et thérapeutiques de la COVID-19 qui visent à bloquer l’infection virale.
