Bonjour, dans cette vidéo, nous allons vous montrer comment explorer les épitranscriptomes m6A et m5C lors d’une infection virale. Pour commencer l’expérience, vous aurez besoin de 50 millions de cellules pour les non-infectés et de 50 millions pour la maladie infectée. Afin d’obtenir un ensemble de données de haute qualité lors de l’analyse, vous devrez obtenir une infection universelle.
Ici, nous infectons ces cellules avec un vecteur à base de VIH et mesurons la GFP codée viralement par FACS. Dans ce cas, nous avions 80% de cellules infectées et nous avons procédé au flux de travail en commençant par l’extraction totale de l’ARN. Nous avons donc divisé les cellules en aliquotes de 10 millions chacune et les avons lysées en 1 mL de Trizol.
Nous avons ensuite ajouté 200 microlitres de chloroforme au lysat cellulaire et mélangé par inversion. À ce stade, nous laissons le lysat reposer pendant trois minutes à température ambiante, puis nous centrifugons tous les échantillons à grande vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés. Vous vous attendrez à voir une séparation de phase en trois phases différentes, comme indiqué ici.
L’ARN est assis dans la phase supérieure, alors transférez soigneusement la phase aqueuse dans un tube frais en faisant attention à ne pas transférer la couche organique. À ce stade, ajouter 0,5 mL d’isopropanol à la phase aqueuse et mélanger soigneusement par inversion. Les échantillons peuvent ensuite être incubés une heure à 80 degrés pour assurer la précipitation de l’ARN.
Lors de la centrifugation à grande vitesse, vous devriez être en mesure de voir une belle pastille d’ARN comme indiqué ici. Jetez soigneusement le surnageant soit par inversion, soit par pipetage, en faisant attention à ne pas perturber la pastille. Ensuite, lavez la pastille d’ARN avec un mL d’éthanol de qualité moléculaire à 75%.
Et vortex l’échantillon brièvement. Lors de la centrifugation, assurez-vous de récupérer une belle pastille d’ARN blanc. Jeter le surnageant et laisser sécher la pastille d’ARN pendant 15 minutes à température ambiante.
Remettez en suspension chaque granulé dans 20 microlitres d’eau et regroupez tous les échantillons de la même condition ensemble. L’ARN total est maintenant prêt pour l’isolement de l’ARNm par sélection poly-A. Pour chaque échantillon de 75 microgrammes d’ARN, préparez 200 microlitres de billes magnétiques oligo-DT et lavez-les dans un mL de tampon de liaison.
Placez le tube sur un support magnétique et laissez les perles se lier à l’aimant pendant un mélange. Jetez le surnageant et répétez la procédure pour un deuxième lavage. Retirez ensuite les billes des supports magnétiques et remettez-les soigneusement en suspension dans 100 microlitres de tampon de liaison.
À ce stade, préparez l’échantillon d’ARN en le divisant en 75 microgrammes d’ARN par aliquote remise en suspension dans 100 microlitres d’eau. Ajouter 100 microlitres de tampon de liaison et incuber pendant deux minutes à 65 degrés. Ensuite, faites tourner les échantillons et incubez sur de la glace.
Ajouter ensuite 100 microlitres de billes magnétiques lavées à chaque échantillon d’ARN et laisser se lier sur une roue tournante pendant 15 minutes à température ambiante. Lors de l’incubation, replacez le tube dans un rack magnétique et laissez-les incuber pendant une minute. Ensuite, récupérez le surnageant dans un tube frais et gardez-le de côté pour une deuxième série d’isolement.
Lavez les perles deux fois avec 200 microlitres de tampon de lavage, puis procédez à l’élution. Afin d’éluer l’ARN sélectionné poly-A à partir des billes magnétiques, ajoutez 20 microlitres de TRIS HCl glacé à chaque échantillon et pipetez soigneusement. Ensuite, incubez vos échantillons à 80 degrés pendant deux minutes pour libérer l’ARN des perles.
Transférer le surnageant contenant de l’ARN sélectionné poly-A dans un tube frais, en évitant le report de perles. L’étape d’élution ainsi que l’étape d’isolement doivent être répétées deux fois afin d’augmenter le rendement en ARNm. L’ARNm est maintenant prêt à entrer dans le pipeline meRIP-Seq à l’étape de la fragmentation ou à passer directement à la conversion du bisulfite.
La première étape pour entrer dans le pipeline meRIP-Seq consiste en la fragmentation de l’ARNm. Pour cela, vous avez besoin de cinq microgrammes d’ARNm divisés en aliquotes de 18 microlitres dans des tubes de 0,2 mL. Afin d’assurer la cohérence des données, il est essentiel de travailler rapidement et avec seulement quelques échantillons à ce moment-là.
Pour cette expérience, la fragmentation a été optimisée afin d’obtenir un fragment d’une taille comprise entre 115 et 200 nucléotides. Ajoutez ensuite deux microlitres de réactif de fragmentation à chaque tube contenant 18 microlitres d’ARNm en faisant attention à déposer la gouttelette sur la paroi du tube. Faire tourner tous les échantillons afin de permettre le contact entre le réactif et l’ARN en même temps et incuber à 70 degrés pendant 15 minutes.
Une fois l’incubation terminée, arrêtez la réaction en ajoutant deux microlitres de 0,5 M d’EDTA. À ce stade, vous pouvez purifier votre ARNm fragmenté avec la méthode de votre choix et procéder à un contrôle de la qualité de l’ARN par analyseur de fragments. Cette étape est facultative, mais elle permettra d’évaluer la taille du fragment avant d’engager la précipitation de l’ARN.
Comme vous pouvez le voir ici dans la quatrième voie, nous obtenons pour les deux notre fragment d’échantillon d’environ 150 nucléotides chacun. Nous avons ensuite procédé avec meRIP-Seq. La première étape consiste à coupler des billes magnétiques A / G avec des anticorps anti-m6A ou des témoins IgG.
Pour chaque plan de réaction, transférer 25 microlitres de billes magnétiques dans un tube frais. Veuillez noter que vous aurez besoin d’au moins une condition spécifique à m6A et d’une condition de contrôle. Lavez chaque 25 microlitres de perles avec 250 microlitres de tampon IP.
Remettez doucement en suspension les billes en pipetant de haut en bas et placez le tube sur le rack magnétique pendant une minute afin de permettre la séparation des perles. Retirez et jetez le surnageant, en faisant attention à ne pas aspirer les billes magnétiques et répétez l’étape de lavage une fois. Ensuite, remettez en suspension les billes magnétiques dans 100 microlitres de tampon IP pour chaque 25 microlitres de volume original de perles.
Préparez et étiquetez un tube pour chaque condition. Dans notre cas, nous aurons deux tubes pour la condition infectée, un pour m6A et un pour le contrôle des IgG, et deux tubes pour la condition non infectée. Ajoutez ensuite 100 microlitres de perles lavées dans chaque tube.
Les perles sont maintenant prêtes à être couplées avec des anticorps spécifiques ou des contrôles IgG. Ajouter cinq microgrammes d’anticorps anti-m6A spécifiques ou d’anticorps anti-IgG à chaque tube contenant 100 microlitres de billes magnétiques lavées. Permettre la conjugaison anticorps-billes en incubant le tube 30 minutes sur une roue rotative.
Pendant ce temps, procédez à la préparation des échantillons. Pour chaque condition planifiée, spécifique à m6A ou contrôle des IgG, votre matériau de départ sera de 2,5 microgrammes d’ARNm fragmenté remis en suspension 100 microlitres d’eau. Pour avoir un volume de réaction final de 500 microlitres, ajoutez 295 microlitres d’eau à chaque échantillon.
Ajouter ensuite cinq microlitres d’inhibiteur d’ARN concentré à 40 unités par microlitre pour une quantité totale de 200 unités par échantillon et mélanger doucement. Enfin, ajoutez 100 microlitres de tampon IP concentré 5X à chaque tube. Les échantillons sont maintenant prêts pour la réaction de précipitation immunitaire.
Récupérez les billes magnétiques couplées à l’anticorps de la roue tournante et faites-les tourner vers le bas. Ajouter ensuite 500 microlitres des échantillons préalablement préparés à chaque 100 microlitres de perles couplées aux anticorps spécifiques. Mélanger doucement en pipetant plusieurs fois de haut en bas pour remettre complètement en suspension les perles.
Incuubez-les ou votre réaction meRIP sur une roue rotative à quatre degrés pendant deux heures. Une fois l’incubation terminée, faites tourner chaque tube et placez-les sur un support magnétique pendant une minute pour permettre la séparation des billes. Ensuite, retirez la fraction non liée et placez-la sur un tube frais et conservez-la pour une analyse plus approfondie, si nécessaire.
Retirez l’aimant du rack et remettez en suspension tous les échantillons dans 500 microlitres de tampon IP. Remettez soigneusement en suspension chaque échantillon en piquant de haut en bas. Insérez l’aimant sur le rack, incubez pendant une minute, puis retirez soigneusement le surnageant.
Répétez le lavage deux fois, puis procédez à l’élution. Pour chaque couple d’échantillon, spécifique m6A et témoin, préparer 225 microlitres de tampon d’élution contenant 20 millimolaires de m6A purifié. Ajoutez ensuite 100 microlitres de tampon d’élution par échantillon.
Incuber tous les échantillons une heure à quatre degrés sur une bascule. Ensuite, collectez tout l’échantillon d’ARN enrichi en m6A dans un tube frais et procédez à une deuxième série d’élution. Purifiez l’ARN enrichi m6A avec la méthode de votre choix Et puis à ce stade, les échantillons sont prêts pour la préparation et le séquençage de la bibliothèque.
Pour étudier la modification du m5C, nous utilisons la conversion au bisulfite. Commencez l’expérience avec 500 nanogrammes d’ARN poly-adénylé. Bien que facultatif, l’ajout à votre échantillon de 500 picogrammes d’ARN appauvri en poly-A pour assurer une représentation ribosomique et de 0,5 microlitre de séquence synthétique disponible dans le commerce vous permettra d’évaluer le taux de conversion du bisulfite lors du séquençage.
Ajustez votre échantillon à un volume final de 20 microlitres dans l’eau, puis ajoutez 130 microlitres de réactif de conversion d’ARN à chaque échantillon. Mélanger soigneusement en pipetant de haut en bas et faire tourner tout l’échantillon vers le bas pour s’assurer qu’il n’y a plus de gouttelettes sur le côté des tubes. Incuber tout l’échantillon dans une machine PCR pendant trois cycles de dénaturation à 70 degrés pendant cinq minutes et de conversion de bisulfite à 54 degrés pendant 45 minutes.
Effectuez un désamination en colonne en ajoutant directement sur une colonne vide, 250 microlitres de tampon de liaison à l’ARN, 150 microlitres de votre échantillon converti en bisulfite. Mélangez l’échantillon en pipetant de haut en bas, mais en faisant attention à ne pas toucher les filtres de colonne. Ajouter 400 microlitres d’éthanol à 95-100% au mélange tampon de liaison à l’ARN de l’échantillon directement dans la colonne.
Fermez le capuchon et mélangez immédiatement par inversion. Faites tourner votre échantillon pendant 30 secondes et jetez le flux. Lavez votre colonne avec un tampon de lavage, puis ajoutez 200 microlitres de solution de désulfonation au centre de chaque colonne.
Incubez tout votre échantillon pendant 30 minutes à température ambiante. Faites tourner l’échantillon pendant 30 secondes, puis procédez à deux tours de lavage. Ajouter 400 microlitres de tampon de lavage à chaque échantillon, centrifuger pendant 30 secondes à pleine vitesse et jeter le flux.
Placez la colonne dans un nouveau tube vide et éluez l’ARN converti en bisulfite en 20 microlitres d’eau. Contrôlez l’efficacité de conversion des bisulfites par RT-qPCR, puis passez à la préparation et au séquençage de la bibliothèque. Lors de l’analyse bio-informatique, voici quelques exemples de résultats que vous pouvez obtenir avec ce flux de travail.
Ici, nous comparons l’épitranscriptome des cellules infectées par le VIH par rapport aux cellules non infectées. 24 heures après l’infection. Dans le panneau A, vous pouvez voir les résultats que nous obtenons en explorant l’épitranscriptome m6A.
Dans ce graphique, nous traçons les lectures enrichies m6A sur l’analyse meRIP-Seq. Nous pouvons bien voir qu’un doigt de zinc est hyperméthylé 24 heures après l’infection. Nous avons effectué le même type d’analyse pour l’étude de l’épitranscriptome m5C dans le panel B.In ce graphique, chaque cytosine non méthylée est affichée en rouge, tandis que la proportion de cytosine qui a été méthylée m5C est indiquée en bleu.
Comme vous pouvez le voir, PHLPP1, les trois cytosines qui sont hyper-méthylées 24 heures après l’infection par le VIH. Dans l’ensemble, ce flux de travail permet d’étudier à la fois l’épitranscriptome M6A et m5C des cellules infectées et peut également être appliqué en tant que tel sur les particules virales. La compréhension de l’infection virale est capable de modifier le paysage épitranscriptomique de l’hôte nous donnera accès à une nouvelle couche de régulation.
L’étude des transcriptions méthylées différentielles lors d’une infection virale fournira bien sûr une ressource précieuse pour une nouvelle intervention thérapeutique. Sur le lien ci-dessous, vous pouvez trouver notre ressource en libre accès pour l’étude de la transcription méthylée différentielle sur l’infection par le VIH au fil du temps.
