Nous proposons une méthode de régulation de l’activité de la polymérase à l’aide de facteurs de transcription d’acides nucléiques artificiels. Cette architecture de régulation des gènes peut servir de pierre angulaire pour les futurs dispositifs génétiques in vitro. En attachant un domaine de liaison à l’ADN à une ARN polymérase T7, cette technique combine l’évolutivité des circuits à base d’ADN, avec la fonctionnalité des circuits transcriptionnels.
Commencez par faire neuf dilutions d’oligonucléotide BG simple brin à un volume final de 50 microlitres d’eau distillée double, de cinq à un à un à cinq rapports, comme indiqué dans le tableau. Préparer un mélange réactionnel pour chaque dilution en mélangeant deux microlitres de tampon SNAP avec quatre microlitres d’oligonucléotide BG et quatre microlitres de SNAP T7 RNAP. Préparez le contrôle RNAP en remplaçant l’oligonucléotide par de l’eau double distillée, et le contrôle de l’ADN en remplaçant le SNAP T7 RNAP par de l’eau double distillée.
Établissez 11 réactions en ajoutant deux microlitres de chaque échantillon à quatre microlitres de tampon SNAP et deux microlitres de colorant à charge protéique par échantillon. Chauffer les réactions pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius, avant de charger deux microlitres de chaque échantillon sur un gel protéique vitré à quatre à 12% pendant 35 minutes d’électrophorèse sur gel sur glace à 200 volts. À la fin de la course, lavez le gel avec trois échanges d’eau sur un shaker pendant au moins 10 minutes par lavage, suivi d’une coloration aux acides nucléiques avec un colorant cyanine pendant 15 minutes.
Imagez le gel sur un système d’imagerie de gel approprié et colorez à nouveau le gel avec 20 millilitres de bleu Coomassie. Après une heure, décolorez avec de l’eau distillée double pendant au moins une heure avant d’imager à nouveau le gel. Pour la purification SNAP T7 liée aux oligonucléotides, préparez d’abord un tampon d’élution en mélangeant 50 microlitres d’une trace molaire, avec 100 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaires, avec 850 microlitres d’eau double distillée.
Ensuite, placez une colonne d’échange d’ions par échantillon dans des tubes centrifugeux individuels de deux millilitres et lavez les colonnes avec un tampon de purification par centrifugation jusqu’à ce que tout le tampon ait été élué de chaque colonne. Diluer chaque échantillon avec un tampon de purification à un rapport tampon de purification de trois à un sur échantillon et charger 400 microlitres d’échantillon dans chaque colonne. Lorsque tout le tampon a été élué comme démontré, prélever et étiqueter le flux pour chaque échantillon.
Lavez les colonnes trois fois avec 400 microlitres de tampon de purification par lavage jusqu’à ce que tout le tampon ait été élué par lavage, en collectant et en étiquetant les écoulements selon le cas. Après le dernier lavage, collectez la protéine éluée en ajoutant 50 microlitres de tampon d’élution au centre de la colonne et en centrifugant la colonne trois fois jusqu’à ce que les 50 microlitres de tampon aient été élués. Recueillir et étiqueter l’élute après chaque centrifugation, en regroupant l’éluat dans un seul tube après la dernière centrifugation, tout en laissant un petit volume de chaque élute pour l’analyse du gel.
Mesurez l’absorbance des aliquotes d’éluats restantes à 260 et 280 nanomètres et ajoutez du glycérol aux échantillons dans un rapport de un pour un stockage de moins 20 degrés jusqu’à leur utilisation. Utilisez une unité de filtre central de 500 microlitres et 30 kilodaltons pour remplacer en tampon l’élute totale avec 2x tampon de stockage. Et mesurez l’absorbance comme démontré.
Ensuite, ajoutez du glycérol au produit à un rapport de un pour un pour un stockage de moins 20 degrés Celsius. Pour évaluer les éluats par SDS-PAGE, exécutez les échantillons dans une échelle protéique appropriée sur un gel vitré à quatre à 12% pendant 35 minutes à 200 volts, ou jusqu’à ce que le front de colorant migre vers l’extrémité du gel. Pour démontrer l’activité de contrôle à la demande de l’ARNP attaché, mélangez 2,4 microlitres de chaque gabarit avec cinq microlitres de tampon de recuit 5x et 14,2 microlitres d’eau distillée double.
Incuber le CAGE d’ADN double brin micromolaire résultant à 75 degrés Celsius pendant deux minutes. Et recuit les souches sensorielles et anti-sens du modèle d’ADN d’aptamère vert promoteur et malachite de la même manière que celle indiquée dans le tableau. À la fin des incubations, ajouter le SNAP T7 RNAP attaché à la CAGE d’ADN double brin à un rapport de une à cinq molaires à une concentration finale de 500 nanomolaires RNAP.
Après 15 minutes à température ambiante, placer l’échantillon sur de la glace et mélanger 2,5 microlitres de 10x tampon de transcription in vitro avec un microlitre de 25 millimolaires ribonucléoside triphosphate, un microlitre d’un millimolaire vert malachite, 2,5 microlitres du mélange RNAP CAGE, 2,5 microlitres chacun d’un brin d’oligonucléotides des facteurs de transcription micromolaires A et B, et trois microlitres d’un gabarit d’aptamère vert malachite millimolaire dans 10 microlitres d’eau double distillée. Dans 15 microlitres d’eau double distillée, mettre en place une deuxième réaction contenant 2,5 microlitres de 10x tampon de transcription in vitro, un microlitre de mélange triphosphate ribonucléoside de 25 millimolaires, un microlitre d’un millimolaire vert malachite, 2,5 microlitres du mélange RNAP CAGE et trois microlitres d’un gabarit d’aptamère vert malachite millimolaire. Pour mettre en place une réaction contenant uniquement un tampon, mélanger 2,5 microlitres de 10x tampon de transcription in vitro, un microlitre de mélange triphosphate ribonucléoside millimolaire, un microlitre d’un vert de malachite millimolaire et trois microlitres d’un gabarit d’aptamère vert malachite millimolaire dans 17,5 microlitres d’eau double distillée.
Lorsque toutes les réactions ont été préparées, transférez chaque réaction sur une plaque de 384 puits et surveillez la transcription de l’aptamère vert malachite sur un lecteur de plaque de fluorescence pendant deux heures à 37 degrés Celsius à une excitation de 610 nanomètres et une émission de 655 nanomètres. À la fin de la lecture, placez la plaque sur de la glace et faites couler le produit d’ARN de chaque puits dans un gel polyacrylique dénaturant à 12% de TBE-urée dans un tampon TBE de 70 degrés Celsius à 280 volts pendant 20 minutes, ou jusqu’à ce que le front de teinture atteigne l’extrémité du gel. Ensuite, colorez le gel avec une coloration d’acide nucléique de colorant cyanine pendant 10 minutes sur un agitateur orbital, avant l’imagerie comme démontré.
Une expression et une purification réussies de la protéine RECOMBINANTE SNAP T7 RNAP peuvent être confirmées à l’aide de SDS-PAGE. Suite à SDS-PAGE, l’activité enzymatique peut être validée par réaction de transcription in vitro. Le couplage réussi des oligonucléotides fonctionnalisés BG peut être vérifié via 18% de dénaturation TBE-urée PAGE.
Par rapport à l’oligonucléotide non modifié, l’ajout de la fraction BG à l’oligonucléotide augmente son poids moléculaire. Comme observé dans ce gel colorant cyanine représentatif pour confirmer la purification du RNAP T7 attaché à l’ADN de l’excès d’oligonucléotides BG, le flux initial à travers la fraction contenait principalement un excès d’oligonucléotide BG, ainsi qu’une petite partie de la polymérase attachée à l’ADN qui ne se liait pas à la résine échangeuse de cations. Les fractions de dilution du pool ne contenaient que la seule bande d’oligo RNAP causée par la liaison du colorant cyanine à l’attache oligonucléotidique, la voie de produit concentrée vers le haut présentant la même bande, mais plus sombre, signifiant une concentration ascendante réussie.
Les mêmes schémas sont observés par la coloration bleue de Coomassie, avec un petit changement de mobilité du gel observé dans le contrôle RNAP non conjugué. Ici, le signal fluorescent produit à la fin de la transcription in vitro en cinétique en temps réel est montré. Dans cette analyse, une activation de 336 fois dans le signal de fluorescence a été observée, démontrant un contrôle robuste de l’activité de la polymérase.
Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de bien laver les FDS du gel avant la coloration par acide nucléique. En effet, STS va piéger le colorant dans le gel, ce qui entraîne un signal de fond élevé. L’application de notre méthode à un grand circuit de gènes avec de multiples cascades montrera l’évolutivité et la composabilité du système de transcription attaché.
Cette technique est actuellement utilisée pour développer des circuits géniques capables de calculer de type réseau neuronal.
