Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Ce protocole montre deux façons distinctes de détecter NKG2DLs sur la surface des cellules AML. La technique fournit une méthode de coloration rapide et conviviale pour détecter tous les NKG2DLs connus et éventuellement inconnus. Cette méthode permet de séparer les cellules souches leucémiques des cellules de la LAM en vrac, ce qui permet de caractériser davantage ces cellules.

Commencez par décongeler la biotine et les tubes protéiques de fusion NKG2D à température ambiante. Faites tourner rapidement la poudre NKG2D FC, puis ajoutez 500 microlitres de PBS pour reconstituer la poudre et mélangez bien à l’aide d’une micropipette P-1000. Ajouter 100 microlitres de la protéine de fusion NKG2DL à un tube de biotine pour obtenir une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre, et bien mélanger la solution avec une micropipette P-100.

Pour décongeler les cellules de la LAM, retirez le cryovial contenant la LAM primaire du stockage d’azote liquide et placez-le immédiatement dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Déplacez doucement le tube d’avant en arrière dans l’eau, ce qui permet au contenu du flacon de dégeler jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans le tube contenant le milieu et rincer le flacon à l’aide d’un millilitre de milieu.

Centrifuger les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes et jeter le surnageant sans perturber le culot. Laver les cellules avec cinq millilitres de milieu RPMI contenant 10% FCS et répéter la centrifugation. Ressusciter le culot cellulaire avec un tampon de coloration à une concentration finale de 0,5 fois 10 à la septième cellule par millilitre.

Puis transférer 100 microlitres de la suspension cellulaire vers une culture cellulaire 96 puits U-bottom plaque et centrifuger la plaque à 300 fois G pendant 10 minutes. Jetez le surnageant sans déranger la pastille. Préparer un mélange maître de protéine de fusion NKG2D biotinylée afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 microlitres par puits avec une concentration finale de NKG2D de 10 microgrammes par millilitre par puits.

Ajouter le mélange maître préparé et ressusciter les pastilles de la cellule avec une pipette de 200 microlitres. Incuber et centrifuger la plaque comme décrit dans le manuscrit du texte. Préparer un mélange maître à l’aide de streptavidine PE afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 microlitres.

Ajoutez le mélange maître aux cellules et ressuscitez les pastilles avec une pipette multicanal de 300 microlitres. Après avoir centrifugé la plaque et jeté le surnageant, utilisez une micropipette multicanal de 300 microlitres pour ressusciter les pastilles cellulaires dans 200 microlitres de tampon de coloration plus 7-AAD. Ensuite, analysez les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux.

Les échantillons analysés de la LAM sont positifs pour CD34 et NKG2DL, mais il existe également des sous-populations négatives, avec quatre populations différentes au total. La stratégie de gating typique commence par la sélection de la population principale de cellules via leur FSC et SSC. Les doublets et les cellules mortes sont exclus de l’analyse en aval.

Les barrières sont ajustées à l’aide de contrôles FMO pour assurer une identification appropriée des cellules positives. Les intensités de fluorescence des cellules positives pour CD34 par rapport à NKG2DL sont mises en évidence ici. Les cellules de la LAM qui sont positives pour CD34 montrent une expression de surface inférieure de NKG2DL, ce qui indique que l’expression de NKG2DL est associée à un manque de stemness.

Trois échantillons primaires d’AML ont démontré des événements positifs 19,8, 49,8, et 89,4% pour la souillure de protéine de fusion contre 20,4, 50,4, et 90,6% pour la souillure groupée d’anticorps d’anti-NKG2DL. D’autre part, la souillure simple de ligand a montré une gamme d’événements positifs jusqu’à 92% avec les pourcentages variant basés sur le ligand. Lorsque vous essayez cette méthode, il est très important d’être rapide lors de la décongélation des cellules primaires de la LAM, car elles sont fragiles et peuvent mourir facilement au cours de cette étape.

Après avoir effectué ce protocole, un tri de cellules basé sur le signal NKG2DL peut être effectué pour étudier plus en détail les populations.