La tomographie confoccale a été développée pour obtenir la gamme complète des comportements de cellules cancéreuses, car ils interagissent avec la barrière cellulaire et la niche. Cette méthode fournit une base pour étudier les métastases au fur et à mesure qu’elles se produisent. Cette approche est utile pour quantifier le comportement des cellules vivantes.
La tomographie confoccale, lorsqu’elle est combinée à l’apprentissage automatique, est utile pour une variété de plates-formes d’orgue sur puce. L’analyse de tumeurs primaires ou récurrentes ou de cellules tumorales circulantes peut constituer un outil de diagnostic important pour prédire les métastases cérébrales et discerner le cerveau métastatique à partir de cellules métastatiques non cérébrales. Pour assembler le dispositif microfluidique BBN, transférez un dispositif du desiccateur sous vide sur une surface appropriée avec les entrées orientées vers le bas et placez l’ensemble de la configuration dans une chambre plasmatique.
Placez toute la configuration dans une chambre plasma et tirez un aspirateur avant de traiter l’appareil avec du plasma pendant 30 secondes à 80 Watts. À la fin du traitement, utilisez un guide pour placer rapidement l’appareil, côté entrée vers le haut sur la glissière de verre sur le banc de laboratoire pour créer un lien permanent entre les PDA de l’appareil et la diapositive. Ensuite, insérez 200 pointes de pipette de microlitres, coupez deux millimètres de la pointe dans toutes les entrées et sorties et placez l’appareil dans la chambre plasmatique pour un traitement plasmatique de huit minutes et de 200 watts.
Une fois l’appareil refroidi, placez l’appareil dans un récipient secondaire stérile et dans les 15 minutes suivant le traitement plasmide, transférez 120 microlitres d’une solution d’astrocyte de collagène dans l’appareil par la pointe pipette pour la chambre inférieure. Laissez la solution s’évacue à travers la chambre dans la pointe de pipette opposée et remplissez le canal suivant de l’appareil. Lorsque les quatre canaux de l’appareil ont été remplis, placez la puce dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure.
Lorsque le collagène a pris, facturez tous les bouts de pipette alimentant la chambre inférieure avec le milieu complet approprié de culture cellulaire et enrobez la chambre supérieure avec le matrigel réduit de facteur de croissance de 2%, dans le milieu endothélial complet. Lorsque les deux chambres ont été codées, placez l’appareil dans l’incubateur pendant une heure avant de rincer la chambre haute avec le support approprié. En alternant les pointes, voir 30 microlitres d’une fois 10 à la sixième cellules endothéliales par millilitre de milieu approprié, à travers les pointes dans la chambre haute toutes les 15 minutes, pour un total de quatre aliquots de cellules par pointe.
Incuber l’appareil entre les semis. Lorsque toutes les cellules endothéliales ont été ensemencées, remplissez tous les bouts avec le milieu et retournez l’appareil à l’incubateur de culture cellulaire pendant 48 heures. Lorsque la couche endothéliale a mûri, remplacez le milieu de la puce pour reconstituer le milieu de culture cellulaire et ensemencer chaque canal de chambre supérieur avec 30 microlitres d’une fois 10 aux six cellules cancéreuses par millilitre de milieu approprié.
Après chaque aliquot de 30 microlitres de cellules a été ensemencé, retourner l’appareil à l’incubateur pendant 15 minutes, puis remplir tous les conseils avec le milieu approprié retourner l’appareil à l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 à 48 heures. Une fois que l’appareil a été cultivé et photographié, pour mesurer le phénotype des cellules cancéreuses, ouvrez le logiciel fourni et lisez l’image confoccale en mémoire. Le logiciel enregistrera chaque canal couleur de l’image confoccale 3D dans un fichier TIFF distinct.
Sélectionnez les valeurs d’opacité de changement pour chaque canal microscope et ajustez la valeur alpha du canal pour les canaux de couleur présents dans l’image, de sorte que l’arrière-plan est enlevé et que seuls les fluorescents dans les cellules restent. Pour visualiser l’effet, sélectionnez Afficher un rendu 3D pour vérifier que le seuil est défini correctement et si l’image semble correcte, enregistrez les valeurs d’opacité dans la feuille de calcul du tracker d’expérience. Ensuite, utilisez des cubes de marche pour convertir l’image en volume en objets triangulaires individuels sauvegardés dans le format de données VTK.
Pour installer un avion à la barrière endothéliale, localisez d’abord les centroïdes cellulaires. Utilisez le filtre de connectivité polydonnée pour itérer à travers la liste des mailles dans le fichier VTK pour extraire les régions qui ne sont pas connectées. Calculez le centroïde de chaque maille et ajoutez la mesure à une liste de centroïdes filtrant pour les mailles trop grandes ou trop petites.
Pour adapter un plan à la liste des centroïdes pour les cellules endothéliales, utilisez une minimisation de la méthode d’erreur, exécutez Visualize DFP centroïdes et plane fit’to générer et tracer l’ajustement de l’avion et inspecter l’ajustement de l’avion, en ajustant l’ajustement manuellement au besoin. Lorsque l’avion a été correctement monté, enregistrer la normale de l’avion dans le fichier tracker d’expérience. Pour mesurer chaque phénotype des cellules cancéreuses après avoir caractérisé la couche endothéliale avec un plan, chargez la fonction d’analyse cellulaire et exécutez Lire dans l’expérience tracker informations et d’analyser les canaux qui existent « pour itérer et analyser chaque région dans le fichier VTK.
Pour chaque région, la fonction coupera chaque cellule de sorte que le maillage au-dessous de la membrane soit calculé. Pour mesurer le phénotype cellulaire, calculez la forme, le volume et la position de chaque cellule cancéreuse. Mesurez ensuite le volume et la position de chaque cellule cancéreuse coupée pour calculer le pourcentage de cellules qui ont été extravasées par la barrière endothéliale.
Après avoir effectué ces étapes pour plusieurs expériences exécuter Exporter les données comme un seul fichier xlsx 'pour enregistrer les données dans une feuille de calcul. Une puce BBN microfluidique avec une barrière endothéliale confluente est acceptable pour l’expérimentation, tandis qu’une puce BBN microfluidique avec une couverture endothéliale particulièrement faible, ne l’est pas. Dans cette analyse représentative de la lignée des cellules cancéreuses à la recherche du cerveau, présente une sous-population de cellules qui extravasates à travers la barrière endothéliale et migre profondément dans l’espace de niche du cerveau de la puce microfluidique BBN À deux et neuf jours après l’exposition, les cellules cancéreuses parentales maintenu une proportion substantielle de cellules sur le dessus de la barrière loin de l’espace de niche du cerveau , tandis que la population de cellules cancéreuses métastatiques du cerveau a maintenu une proportion de cellules supérieures à 100 % extravasées.
La quantification morphologique de la forme des cellules cancéreuses a indiqué que les cellules parentales ont démontré moins de cellules sphériquement formées le premier jour après l’ensemencement, tandis qu’après deux et neuf jours d’interaction, les deux lignées de cellules cancéreuses tendaient à diminuer leur sphérité. En outre, les sous-populations de cellules cancéreuses qui ont extravasé dans la niche astricydique étaient plus petites en taille, comparées aux cellules cancéreuses qui sont restées en interaction avec la barrière endothéliale sans extravaser dans le cerveau. Les lignées de cellules cancéreuses de recherche de cerveau et les xénogreffes dérivées du patient, montrent un modèle phénotypique dans la puce microfluidique de BBN qui pourrait être exploitée pour différencier entre les cellules cancéreuses métastatiques et non cérébrales de cerveau par l’apprentissage automatique.
L’auto-sélection est importante. Les cellules endothéliales avec un nombre de passage plus élevé et faible présentaient des comportements de barrière variables. De plus, les cellules cancéreuses et leur expression fluorescente peuvent changer avec le temps.
Après cette procédure, les chercheurs peuvent employer le profilage moléculaire de la maison du secret ou des cellules dans l’appareil afin d’étudier les mécanismes moléculaires des métastases. Cette technique permet d’explorer des interactions complexes entre les cellules cancéreuses et leurs microenvironnements, en combinant un microenvironnement conçu avec une imagerie quantitative de composants de niche au fil du temps.
