Création de paires de modèles appariés in vivo/in vitro dérivés du patient d’organoïdes dérivés de PDX et de PDX pour la recherche en pharmacologie du cancer

Ce protocole peut être utilisé pour établir une bibliothèque appariée de xénogreffes dérivées du patient appariées, ou PDX, et de lignes organoïdes dérivées du patient correspondantes. L’avantage de cette méthode est qu’elle peut être utilisée pour créer des organoïdes à l’aide de PDX pour le dépistage in vitro, ce qui donne des paires appariées de modèles in vivo/in vitro. Commencez par récolter les tumeurs et traiter le tissu comme décrit dans le manuscrit de texte.

Après la digestion des tissus, pipeter le tissu de haut en bas avec une pipette en plastique stérile de cinq millilitres. Ajoutez ensuite 20 millilitres d’AD+ à l’homogénat et filtrez-le avec une passoire cellulaire de 100 micromètres. Lavez le filtrat deux fois avec AD+, puis transférez-le dans un tube en plastique et centrifugez-le à 450 fois G pendant cinq minutes.

Ressusciter les cellules dans le BME et les garder sur la glace. Pour préparer la culture organoïde, transférer 200 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de six puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ajoutez deux millilitres de milieux organoïdes à chaque puits et imaginez les gouttes représentatives au microscope.

Maintenir les cultures organoïdes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avec des changements de milieu tous les trois à quatre jours et un passage à un rapport d’un à deux tous les sept jours. Après avoir dissocié les organoïdes, passez-les à travers un filtre de 70 micromètres dans un tube en plastique de 50 millilitres. Comptez les organoïdes au microscope et ressuscitez-les dans du BME sur de la glace pour une concentration finale de 5%Ajouter 50 microlitres de la suspension organoïde dans chaque plaque de 384 puits avec un distributeur de liquide pour une densité d’ensemencement de 200 CR2110 PDXO par puits.

Utilisez le distributeur numérique pour ajouter du SN38 à chaque puits en dilution en série. Créez une carte de plaque à l’aide de l’outil logiciel de distributeur numérique. Les traitements devraient inclure un véhicule témoin négatif avec une viabilité de 100% et un contrôle positif de cinq staurosporines micromolaires avec une viabilité de 0%.

Une fois terminé, replacez les plaques de 384 puits traitées par le médicament dans un incubateur à 37 degrés Celsius. En microscopie optique, PDXO CR2110 montre une morphologie kystique typique démontrant la similitude entre les organoïdes dérivés de PDX et les organoïdes dérivés du patient dans les mêmes conditions de culture. L’examen histopathologique par la souillure de H&E indique que les structures tissulaires et les types de cellules de PDXO CR2110 sont semblables au PDX CR2110 original.

Les comparaisons de profils génomiques de PDX et de PDXO démontrent une corrélation de 94,92 % de l’expression du transcriptome et une concordance de 97,67 % des mutations de l’ADN, ce qui suggère une similitude génomique globale entre cette paire de modèles. Des analyses de sensibilité de drogue ont été exécutées sur PDXO CR2110 dans des plaques de 384 puits. PDXO CR2110 était sensible à l’irinotécan et résistant au cisplatine, compatible avec les résultats du traitement PDX.

La paire appariée de modèles in vitro et in vivo peut se compléter pour le dépistage et la validation in vitro in vivo, améliorant ainsi le taux de réussite de la découverte de médicaments et réduisant potentiellement les taux d’attrition dans le développement clinique.