En utilisant notre protocole, le multicouche des dilutions bioink liquides favorise non seulement une dispersion homogène des cellules encapsulées, mais maintient également un environnement bioink adapté aux cellules. Nous utilisons la tension interfaciale pour arrêter la sédimentation des cellules encapsulées dans le réservoir de bioink, en évitant la charge de stress de cisaillement élevée pour les cellules lors de l’impression d’extrusion. En utilisant cette technologie, nous pouvons générer des constructions de tissus 3D avec une distribution cellulaire homogène, fournissant un moule fonctionnel de tissu in vitro pour une utilisation dans les études de médecine de dépistage et de régénération des médicaments.
Lors de la préparation du bioink, il est important de prêter attention à la température expérimentale et la procédure de chargement hygrogel, car ces facteurs peuvent affecter la qualité de l’encre. Avant de commencer la préparation, utilisez des unités de filtre à seringues de 0,22 micromètre pour stériliser tous les matériaux et dissoudre la gélatine à une concentration finale de 10 % en PBS de 50 degrés Celsius dans un cabinet de sécurité biologique. Ajouter l’anhydride méthacrylique à la solution de gélatine à un rapport de poids de 0,6 à un avec agitation lente pendant au moins une heure à 50 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, transférer la solution mixte dans un tube stérile de 50 millilitres et séparer la solution en couches par centrifugation. Recueillir la couche supérieure de GelMA et diluer la solution recueillie avec deux volumes d’eau déionisée de 40 à 50 degrés Celsius. Dialyz la solution GelMA avec une membrane de dialyse de 12 à 14 kilodaltons de coupure de poids moléculaire contre l’eau déionisée pendant cinq à sept jours à 40 à 50 degrés Celsius, changeant l’eau deux fois par jour.
À la fin de la dialyse, congeler la solution GelMA à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit. Lyophiliser ensuite la solution GelMA pendant trois à cinq jours dans un séchoir à congélation à moins 45 degrés Celsius et 0,2 millibars de pression. Puis dissoudre le GelMA lyophilisé dans PBS complété par 10% sérum bovin fœtal, 25 millimolar HEPES, et 0,5% photoinitiateur.
Pour obtenir les bioinks gelma fibroin de soie, mélangez la solution GelMA avec différents volumes de solution initiale de fibroine de soie et différents volumes de PBS comme suggéré dans le tableau. Lorsque tous les bioinks ont été préparés, sonicate la solution pendant 10 à 20 minutes. Pendant que les encres sonifient, recueillez les cellules d’une culture cellulaire NIH/3T3 confluente de 80 % dans un tube conique de 15 millilitres par solution de bioink, et granulez les cellules par centrifugation.
Ensuite, aspirez soigneusement les supernatants et resuspendez les cellules dans chaque tube avec deux millilitres de bioink à une fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration de solution de bioink. Pour charger le bioink pour l’impression, ajouter aspirer 400 microlitres de fibrocine de soie chargée de cellules 0,5 GelMA à la couche inférieure d’une seringue de deux millilitres. Placez la seringue dans un bain d’eau glacée de zéro degré Celsius pendant cinq minutes pour transformer le bioink de la couche inférieure en un état de gel avant de charger 400 microlitres de fibroine de soie chargée de cellules 0,75 gelma bioink sur la couche de fibroine de soie 0,5 GelMA.
Ensuite, retournez la seringue au bain de glace pendant cinq minutes, en continuant d’ajouter chaque concentration supplémentaire de bioink chargé de cellules à la seringue de la même manière. Lorsqu’un système de bioink multicououche avec différentes concentrations de fibroine de soie dans les différentes couches a été réalisé, réchauffer le bioink dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, chargez une buse d’impression de calibre 27 sur la seringue et réglez la vitesse d’écoulement à 50 microlitres par minute, la vitesse de déplacement de la buse à deux millilitres par seconde et la hauteur de la buse à un millimètre.
Ensuite, imprimez le tissu construit d’une manière d’extrusion à l’aide d’un bioimprimeur sur mesure à température ambiante, et reliez la construction de tissu bioimprimé avec 365 nanomètres de lumière ultraviolette pendant 40 secondes à 800 milliwatts. Puis la culture de la construction de tissu inter-lié dans DMEM complété avec 10% sérum bovin foetal et 1% pénicilline-streptomycine dans un incubateur de culture cellulaire, changeant le milieu toutes les huit heures pendant les deux premiers jours et tous les deux à trois jours par la suite. Dans cette analyse représentative, au fur et à mesure que la procédure de bioimpression progressait, la densité des cellules dans les puits cibles diminuait dans tous les groupes.
Dans le groupe gelma de fibroine de soie zéro, approximativement 70% des cellules ont été déposées dans la couche inférieure. Dans la fibroine de soie un Groupe gelma, environ 40% des cellules ont été déposées dans la couche inférieure, et environ 5% des cellules ont été déposées dans la couche supérieure. Dans le groupe gelMA multicouche de fibroine de soie, le dépôt des cellules encapsulées était plus homogène que celui des groupes témoin.
La partie la plus critique de ce protocole est le chargement des multicouches bioink SF-GelMA. Ce protocole peut être appliqué à d’autres analyses de bioimpression d’extrusion qui utilisent des bioinks liquides.
