LarvaSPA est la première méthode qui permet l’imagerie continue en direct des larves intactes de drosophile pendant plus de 10 heures avec une résolution temporelle et spatiale élevée. Cette méthode est utilisée pour révéler les processus cellulaires dynamiques des larves neurones sensoriels périphériques et pour étudier de nombreux autres processus cellulaires qui se produisent près de la paroi du corps larve. Cette méthode est facile à utiliser et a moins de limitation sur la taille des larves.
Six à neuf larves peuvent être montées dans la chambre d’imagerie en même temps, ce qui rend l’expérience possible. La chambre d’imagerie des cuboïdes PDMS peut être fabriquée à un coût minime et réutilisable. Cette méthode est particulièrement utile pour étudier les mécanismes de développement de dendrite et de dégénérescence de dendrite utilisant des neurones d’autorisation de larve drosophila.
Être capable d’image du même neurone pendant des heures peut révéler comment les changements mondiaux à long terme des modèles dendritiques découlent de comportements à court terme au niveau des branches individuelles. L’utilisation de cuboïdes PDMS qui correspondent à la taille des larves augmentera le taux de réussite des larves immobilisées. S’il vous plaît trouver des bandes plus utiles dans notre section de dépannage.
Après avoir construit un bloc d’aluminium à partir d’un atelier d’usinage, sceller le fond du cadre métallique à l’aide d’un long glissement de couverture avec de la colle UV. Guérir l’indice UV à l’aide d’une lampe UV portatif pendant 30 secondes. Fixez des couches de ruban d’emballage à la surface intérieure d’une boîte rectangulaire de Pétri ou d’une plaque de culture cellulaire ronde.
Utilisez une couche pour les deuxièmes larves dans l’étoile, deux couches pour les larves du début du tiers dans l’étoile, ou trois couches pour les larves de la fin de la troisième étoile. Coupez le ruban en voyages de largeur spécifique à l’aide d’une lame de rasoir, de 1,5 millimètre pour le ruban d’une couche et de deux millimètres pour le ruban adhésif à deux couches ou à trois couches. Laissez au moins un espace de cinq millimètres entre les deux bandes.
Retirez les couches de ruban couvrant l’espace. Retirer la poussière de la surface intérieure de la plaque à l’aide de ruban adhésif. Après cela, le moule est prêt à l’emploi.
Pour préparer le mélange PDMS, mélanger sept grammes de base PDMS dans 0,7 grammes d’agent de séchage à fond dans un petit récipient. Placer le récipient dans un dessiccateur sous vide pendant au moins 15 minutes pour retirer l’air du mélange. Versez lentement environ 5,5 grammes de mélange PDMS sur le moule pour atteindre une épaisseur d’un à deux millimètres.
Placez à nouveau le mélange PDMS dans le dessiccateur sous vide pendant au moins 15 minutes pour retirer les bulles d’air restantes du mélange. Casser les dernières bulles avec une pointe de pipette. Guérir le PDMS sur une surface plane dans un incubateur thermique à 65 degrés Celsius pendant deux heures.
Ensuite, utilisez une lame de rasoir pour desserrer le PDMS durci le long du bord du moule et le détacher du moule. Rangez le PDMS entre deux morceaux de ruban adhésif à température ambiante. Pour les larves précoces et tardives du tiers dans l’étoile, couper le PDMS en huit par deux par un millimètre cuboïdes en positionnant la rainure créée par la bande de ruban adhésif au centre du côté long du cuboïde.
Pour les deuxièmes larves dans l’étoile, couper le cuboïde à huit par un par un millimètre. Pour préparer le slip de couverture supérieur pour le montage, choisissez six cuboïdes PDMS avec des rainures correspondant à la taille des larves. Retirer la poussière de la surface du PDMS avec du ruban adhésif.
Fixez quatre morceaux de ruban adhésif à double face de la taille de 12 x 5 millimètres sur un long glissement de couverture de 22 x 50 millimètres pour fixer les cuboïdes PDMS plus tard. Réglez les espaces entre les deux morceaux de ruban adhésif double face à la même que la largeur de la rainure PDMS. Appliquer une petite goutte de colle UV dans la rainure de chaque cuboïde PDMS et ajouter six petites gouttes de colle UV dans l’espace entre les bandes à double face sur le bordereau de couverture.
Pour préparer les larves au montage, à l’aide d’une paire de forceps, nettoyez les larves dans l’eau pour enlever la nourriture de la surface du corps. Placer les larves propres sur un petit morceau de papier de soie humidifié dans une petite boîte de Pétri sans couvercle et placer la petite boîte de Pétri dans une grande boîte de Pétri contenant un morceau de papier de soie sec. Dans une hotte chimique, utiliser une pipette de transfert en plastique pour appliquer de 160 à 240 microlitres d’isoflurane sur le papier de soie sec et fermer le couvercle de la grande boîte de Pétri.
Attendez deux à trois minutes tout en surveillant les larves. Une fois que leurs crochets buccaux cessent de bouger, sortez les larves de la grande boîte de Pétri. Placez les larves immobilisées sur la colle UV entre les bandes à double face sur le bordereau de couverture avec la cuticule dorsale face à la feuille de couverture.
Couvrir chaque larve d’un bloc PDMS et insérer le tronc de la larve dans la rainure du PDMS. Laissez la tête et la queue de la larve à l’extérieur de la rainure PDMS. Évitez de bloquer les spiracles de la larve par la colle.
Appuyez sur les extrémités du bloc PDMS sur le ruban à double face sans appliquer de force sur la rainure. Tirez doucement sur la queue de la larve pour aplatir la cuticule sous le PDMS. Portez des lunettes de sécurité et utilisez une lampe UV portatif pour guérir la colle UV pendant quatre minutes sur le réglage élevé.
Retournez le couvercle à l’envers et utilisez la lampe UV pour guérir la colle UV pendant encore quatre minutes. Placez un petit morceau de papier de lentille de la taille de 15 x 30 millimètres au bas de la chambre d’imagerie. Humidifier le papier avec 20 à 30 microlitres d’eau.
Placez le bordereau de couverture sur la chambre de sorte que les larves soient orientées vers l’intérieur de la chambre. Utilisez la colle UV pour coller les deux extrémités du glissement du couvercle à la surface métallique. Le côté dorsal des larves est prêt pour l’imagerie au microscope confocal.
Après l’imagerie, retirez l’huile sur le bordereau supérieur à l’aide de papier de lentille. Détachez le couvercle supérieur du cadre métallique en coupant dans l’espace entre le glissement de couverture et le cadre métallique avec une lame de rasoir. La chambre d’imagerie est prête à être réutilisée.
Détachez les cuboïdes PDMS du glissement de couverture supérieur avec des forceps. Rouler les cuboïdes PDMS sur du ruban adhésif pour enlever les résidus de colle et la poussière. Les cuboïdes PDMS sont prêts à être réutilisés.
Dans ce protocole, les larves de drosophiles ont été immobilisées pendant plus de 10 heures pour l’imagerie continue. Ce chiffre montre six larves en fin de troisième étoile montées dans la chambre. Les troncs des larves étaient fixés tandis que leurs têtes et leurs queues étaient libres de se déplacer.
Ici, nous démontrons l’application de LarvaSPA dans l’étude de la dynamique neuronale de dendrite et de la dégénérescence de dendrite utilisant les neurones de classe quatre DA comme modèle. Pour immobiliser avec succès les larves à l’aide de cette méthode, il est essentiel d’arrêter d’exposer les larves aux isofluranes une fois que les crochets buccaux cessent de bouger et de guérir la colle UV avant que les larves ne se réveillent complètement. Pour étudier la dégénérescence et la régénération des dendrites, des lésions au laser peuvent être effectuées lorsque les larves sont immobilisées dans la chambre d’imagerie.
LarvaSPA nous a aidés à comprendre comment les dendrites dynamiques de croissance ne parviennent pas à innervate cellules épidermiques comme dans les protéoglycanes cellulaires hépatiques et comment la phosphatidylsérine est exposée sur les dendrites dégénérants après une blessure au laser. Protégez les yeux avec des lunettes de sécurité tout en utilisant la lampe UV. Assommer les larves à l’aide d’isoflurane doit être effectué dans une hotte de fumée.
