Les récepteurs immunitaires NLR jouent un rôle crucial dans la médiation de la défense des plantes contre divers agents pathogènes. Nous décrivons une méthode d’étiquetage de proximité basée sur TurboID pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine récepteur Toll/interleukin-1 contenant des NLR tels que les récepteurs immunitaires dans les usines de Nicotiana benthamiana. Ce protocole fournit une référence importante pour étudier les interactions protéines-protéines chez d’autres espèces végétales et il peut être étendu à toute protéine d’intérêt dans Nicotiana benthamiana.
L’approche d’étiquetage de proximité basée sur TurboID présente un net avantage par rapport aux approches traditionnelles, car elle peut être utilisée pour capturer in vivo des interactions protéines-protéines transitoires ou faibles. Commencez par cultiver des graines de N.benthamiana dans un sol humide à haute densité. Conservez-les dans une chambre climatique avec une période de 18 heures de lumière et de huit heures de photo sombre à 23 à 25 degrés Celsius.
Gardez les plantes dans la chambre pendant environ quatre semaines jusqu’à ce qu’elles poussent à un stade folio de quatre à huit pour l’agroinfiltration subséquente. Construire des fusions TurboID et transformer les plasmides en cellules compétentes Agrobacterium tumefaciens comme décrit dans le protocole texte. Utilisez une seringue sans aiguille d’un millilitre pour infiltrer l’inoculum de l’épiderme abaxial des feuilles de N.benthamiana entièrement matures.
À 36 heures après la filtration, infiltrer 200 micromolaires de biotine dans les feuilles et maintenir la plante pendant trois à 12 heures supplémentaires avant de récolter le tissu foliaire. Pour recueillir l’échantillon de feuilles, couper les feuilles infiltrées à la base du pétiole, enlever la veine folilaire et congeler le tissu dans de l’azote liquide. Moudre le tissu foliaire à l’aide d’un pilon et d’un mortier et conserver la poudre dans des tubes Falcon de 15 ou 50 millilitres à moins 80 degrés Celsius.
Pour extraire la protéine totale, transférer environ 0,35 grammes de poudre de feuilles dans un tube de deux millilitres. Assurez-vous de maintenir le tissu à basse température dans l’azote liquide pendant ce processus. Ajouter 700 microlitres de tampon de lyse RIPA à la poudre.
Vortex le tube pendant 10 minutes et laisser l’échantillon sur la glace pendant 30 minutes, en mélangeant le contenu toutes les quatre à cinq minutes en inversant les tubes. Centrifuger les tubes à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, recueillir le surnatant.
Retirez la biotine libre en exécutant l’échantillon à travers une colonne de desalting. Retirez le scellant au bas de la colonne et placez-le dans un tube de 50 millilitres. Puis desserrez le bouchon et centrifugez la colonne à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes.
Placez la colonne de desalting dans un tube frais de 50 millilitres et équilibrez la colonne trois fois avec cinq millilitres de tampon de lyse RIPA. Centrifugez-le à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes et jetez le débit à chaque fois. Ajouter 1,5 millilitres d’extrait de protéines au sommet de la résine dans la colonne équilibrée.
Et quand l’extrait entre dans la résine, ajouter 100 autres microlitres de tampon de lyse RIPA. Centrifuger la colonne pendant deux minutes et laisser les échantillons desalted sur la glace jusqu’à nouvel usage. Pour quantifier les extraits de protéines desalted, mesurez l’OD595 à l’aide d’un spectrophotomètre Bio-Rad.
Dessinez la courbe standard en fonction de la valeur de la solution BSA gradient et calculer la concentration des échantillons de protéines desalted. Equilibrer les perles magnétiques conjuguées streptavidine C1 avec un millilitre de tampon de lyse RIPA pendant une minute à température ambiante. Utilisez la grille magnétique pour absorber les perles pendant trois minutes et aspirer doucement la solution.
Répétez ensuite le lavage une fois de plus. Transférer l’extrait de protéines dans les perles magnétiques équilibrées et incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur pour purifier les protéines. Le lendemain, capturer les perles avec un rack magnétique et aspirer le surnatant.
Ensuite, lavez les perles avec 1,7 millilitres de tampon de lavage un en l’ajoutant au tube et l’incuber sur le rotor pendant huit minutes. Retirez le supernatant tel qu’il a été décrit précédemment et répétez le lavage avec 1,7 millilitres de tampon de lavage deux et lavez le tampon trois. Ajouter 1,7 millilitres de Tris HCL de 50 millimolaires pour enlever le détergent.
Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique et retirez le supernatant. Répétez le lavage avec un millilitre de 50 milli mollar Tris HCL et transférez les perles dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Enfin, lavez les perles six fois avec un tampon bicarbonate de bicarbonate de munitions de 50 millimaux pendant cinq minutes par lavage.
Utilisez 100 microlitres de perles pour l’analyse des immunoblots pour confirmer l’enrichissement des protéines biotinylées et congeler flash le reste de l’échantillon à stocker à moins 80 degrés Celsius. Des taches occidentales ont été employées pour analyser l’expression et la biotinylation de protéine dans les feuilles agroinfiltrées de N.benthamiana. Les protéines biotinylées des feuilles infiltrées ont été efficacement enrichies en perles magnétiques conjuguées streptavidine C1 pour une analyse de spectrométrie de masse ultérieure.
Différentes protéines de tailles variées ont été capturées et l’analyse des taches occidentales des protéines enrichies a montré des bandes barbouillées. Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas d’enlever le scellant au bas de la colonne de dessalage et de desserrer les bouchons avant chaque centrifugation. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres protéines d’intérêt dans Nicotiana benthamiana et peut également être utilisé pour étendre le PL TurboID dans d’autres espèces végétales.
