Ce protocole étape par étape montre comment détecter et caractériser fonctionnellement l’activité enzymatique des ligases d’ubiquitine E3 de type RING, in vitro et en planta, grâce à une approche mutagenèse dirigée par le site. En introduisant la mutation dans un domaine RING par mutagenèse dirigée par le site, le mutant déficient en E3 qui en résulte peut être testé en parallèle avec la protéine de type sauvage pour relier l’activité enzymatique à la fonctionnalité. L’élucidation de la base biochimique et mécanique des ligases d’ubiquitine E3 de type RING peut grandement contribuer à notre compréhension de leur signification biologique dans le développement, la signalisation du stress et le maintien de l’homéostasie.
Avec une légère modification du système d’expression in vivo, ce protocole peut être appliqué à l’analyse de n’importe quel ligase E3 de type RING, quelle que soit son origine. Commencez par identifier les Cys conservés et ses acides aminés dans le domaine RING et concevoir des amorces qui portent le codon de substitution d’intérêt flanqué de 15 paires de base de chaque côté du site de mutation. Il est essentiel d’identifier correctement le domaine RING, en particulier ses résidus de cystéine et d’histidine conservés.
Des outils en ligne tels que PROSITE peuvent être utilisés pour le faire. Utilisez les amorces mutagènes dans l’amplification PCR pour introduire la mutation désirée dans le plasmide abritant le gène d’intérêt, en s’assurant d’utiliser une polymése d’ADN haute fidélité, comme le Pfu. Après la PCR, digérer l’ADN méthylé et semi-méthylé parental dérivé d’E.coli en ajoutant trois microlitres d’enzyme de restriction Dpnl directement à la réaction pcr et en l’incubant à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Purifier les plasmides mutagenisés avec une trousse commerciale d’extraction d’ADN, et elute l’ADN dans 50 microlitres d’eau. Ensuite, transformez les cellules dh5-alpha E.coli chimiquement compétentes avec 0,5 microlitres de l’ADN plasmide mutagenisé récupéré selon le protocole du fabricant. Clonez le RING de type sauvage et muté les gènes RING d’intérêt dans le vecteur pMAL-c2 pour fusionner ces gènes avec l’étiquette d’épitope MBP.
Puis, mettre en place la réaction d’ubiquitination in vitro dans un volume total de 30 microlitres, comme décrit dans le manuscrit, et incuber le mélange à 30 degrés Celsius pendant deux heures. Mettre fin à la réaction en mélangeant l’échantillon avec 7,5 microlitres de tampon de chargement SDS-PAGE 5x et en le faisant bouillir pendant cinq minutes, puis séparez les protéines avec 7,5%SDS-polyacrylamide gel électrophoresis. Transférer sur la membrane PVDF, et détecter l’ubiquitination avec ballonnement occidental et anti-FLAG.
Tacher la membrane avec du bleu Coomassie pour vérifier la charge égale de protéines testées de type MBP-RING. Strier les souches d’Agrobacterium tumefaciens portant le gène d’intérêt marqué par l’épitope sur le milieu LB contenant les antibiotiques de sélection appropriés. Après deux jours de croissance à 28 degrés Celsius, choisissez des colonies simples et cultivez-les dans un milieu liquide LB avec des antibiotiques à 28 degrés Celsius et 250 rpm pendant encore 24 heures.
Transférer 100 microlitres de culture agrobactérienne à trois millilitres de LB frais avec des antibiotiques, et incuber la culture pendant quatre à six heures supplémentaires. Faites tourner les cellules à 1 800 g pendant six minutes, jetez le supernatant et résépendez les cellules avec trois millilitres de tampon de lavage. Répétez le lavage deux fois, puis résuspendez les cellules dans le tampon d’induction, et incubez-les pendant 10 à 12 heures supplémentaires à 28 degrés Celsius.
Après l’incubation, centrifuger les cellules à 1 800 g pendant six minutes et jeter le surnatant. Resuspendez les cellules avec deux millilitres de tampon d’infiltration, et déterminez la concentration de bactéries utilisant la valeur OD600. Agroinfiltrez les feuilles de Nicotiana benthamiana de quatre semaines en les piquant doucement avec une aiguille, et injectez à la main agrobactérie avec une seringue, puis encerclez la zone infiltrée avec un marqueur.
Après 36 heures, recueillir le tissu folio infiltré, et le moudre à une poudre fine avec de l’azote liquide. Resuspendez la poudre de tissu avec 300 microlitres de tampon d’extraction de protéines, et centrifugez-la à 15 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un tube frais, ajouter le tampon de chargement 5x SDS-PAGE à une concentration finale de 1x, et faire bouillir l’échantillon pendant cinq minutes.
Ensuite, effectuez l’analyse occidentale de tache pour détecter dans l’ubiquitination de planta. Stries les souches appropriées Agrobacterium tumefaciens portant des gènes marqués d’intérêt ou vecteur vide, et injecter l’Agrobactérie sur les feuilles de Nicotiana benthamiana, comme décrit précédemment. Pour la dégradation des protéines du substrat dépendant de l’E3, suivez le protocole précédemment décrit et effectuez des ballonnements occidentaux avec des anticorps appropriés pour détecter l’accumulation de protéines dans les cellules végétales.
Pour l’inhibition hypersensible de mort cellulaire par réponse-vocifrice e3, surveillez les feuilles agroinfiltrées pour des symptômes de mort cellulaire deux à quatre jours après infiltration. Un résultat typique d’analyse d’ubiquitination in vitro contient un frottis multibande commençant au poids moléculaire de la protéine éprouvée et progressant vers le haut. Comme prévu, les contrôles négatifs manquant des composants individuels ou utilisant MBP n’ont pas démontré le signal barbouillé.
En outre, la coloration bleue Coomassie de la membrane PVDF a montré une charge égale de MBP-RHA1B ou MBP dans tous les contrôles. 11 E2 différents ont été testés pour étudier comment l’ubiquitination in vitro varie en fonction de la combinaison E2 à E3 spécifique. L’activité d’ubiquitination détectée s’est étendue de l’aucun signal à un frottis multibande commençant à différents poids moléculaires, indiquant différents modèles d’ubiquitination.
Les versions RING-et K-mutant de RHA1B ont été testées pour l’ubiquitination in vitro et dans le planta. Le manque d’activité enzymatique de la version RING-mutante est soutenu par son incapacité à générer un frottis multibande in vitro ou à promouvoir le signal de poly-ubiquitination dans le planta. Bien qu’un signal marginal d’auto-ubiquitination ait été détecté in vitro pour le mutant K, seule l’ubiquitination de fond a été détectée dans planta, suggérant que le résidu K146 est également essentiel pour l’activité E3.
Contrairement au RHA1B de type sauvage, le mutant RING dépourvu d’activité ligase E3 n’a pas nui à la mort des cellules de réponse hypersensibles. Le ballonnement occidental a confirmé que le Gpa2 ne s’est pas accumulé en présence de RHA1B de type sauvage, mais le mutant RING n’a eu aucun impact sur la stabilité des protéines. Étant donné qu’une bonne combinaison E2-E3 est nécessaire pour la réaction d’ubiquitination, des tests d’ubiquitination in vitro devraient être effectués en parallèle avec plusieurs enzymes E2 représentant différentes classes d’E2 afin d’éviter de faux résultats négatifs.
Un mutant déficient en ligase E3 facilite l’essai des interactions enzyme-substrat in vivo. En outre, ce mutant confère souvent un phénotype négatif dominant qui peut être utilisé dans les études knockout fonctionnelles comme une approche alternative à RNAi. En utilisant ce protocole, il a été récemment constaté que l’effecteur de nématode RHA1B interfère avec la signalisation immunitaire des plantes d’une manière dépendante de l’E3 en ciblant l’immunorécepteur de la plante Gpa2 pour l’ubiquitination et la dégradation.
