Comparé à d’autres méthodes, ce protocole est plus facile à trouver de nouveaux antagonistes, agonisteres, et modulateurs allosteric quantitativement et qualitativement sans connaître la structure d’hydro-dilution et la formation de la protéine cible. Ce protocole est très efficace, facile à manipuler, économique et disponible dans le commerce. Combinez cette méthode de criblage à haut débit avec l’analyse ITC, les petits peptides fonctionnels peuvent être obtenus quantitativement et qualitativement.
Ying Zhao et Qiang Wang, étudiants diplômés de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez une solution de FGFR2 dans le tampon de revêtement à une concentration de 10 microgrammes par millilitre. Ajouter un millilitre de la solution à un plat de 35 centimètres carrés et tourbillonner à plusieurs reprises jusqu’à ce que la surface soit complètement mouillée.
Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius avec des secousses. Le lendemain, versez la solution de revêtement et ajoutez la solution de blocage préparée. Incuber à quatre degrés Celsius pendant au moins une heure, puis jeter la solution de blocage et laver rapidement la plaque six fois avec tbst tout en s’assurant que le plat ne se dessèche pas.
Reconstituer la bibliothèque de phages d’origine en un millilitre de TBST et l’ajouter au plat enduit. Faire basculer doucement la plaque sur un shaker à température ambiante pendant deux heures. Après cela, jeter le surnatant et laver le plat 10 fois avec tbst.
Elute le phage lié en ajoutant un millilitre de 0,2 molaire glycine HCL au plat et en berçant doucement à température ambiante pendant 10 minutes. Transférer l’élitiste dans un tube de microcentrifugeuse stérilisé et le neutraliser avec 100 microlitres d’une molaire Tris-HCL au pH 9.1. Tout d’abord, préchaupez les plaques LB et IPTG X-Gal préparées à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant utilisation.
À l’aide de pointes de pipette avec des cartouches de filtre, préparer 100 microlitres de dilutions décuplées de l’élitiste dans LB. Une fois que la culture préparée d’E.coli a atteint la phase médiane, distribuez 200 microlitres de la culture dans des tubes de microcentrifugeuse stérilisés un pour chaque dilution élitente. Pour déclencher l’infection, ajouter 50 microlitres de chaque dilution aux tubes contenant la culture e.coli. Vortex rapidement et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Utilisez ensuite des bâtonnets de revêtement pour enrober les plaques LB et IPTG X-GAL de 90 microlitres de ce mélange. Après cinq minutes, inverser les plaques et les incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Comptez les plaques lorsqu’elles apparaissent.
Pour commencer, diluer la culture nocturne en 20 millilitres de LB dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres. Ajouter l’élixent non amplifié et incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses vigoureuses pendant 4-1/2 heures. Ensuite, centrifuger la culture à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Transférer le surnatant dans un tube frais. Centrifugeuse à nouveau en utilisant les mêmes conditions et jeter la pastille. Transférer les 80 % supérieurs du supernatant dans un tube frais et l’ajouter au 1/6e volume de 20 % de polyéthylène glycol et de 2,5 chlorure de sodium molaire.
Laissez le phage se précipiter pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, centrifugeuse le phage précipité à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Jetez à nouveau le supernatant et la centrifugeuse dans les mêmes conditions.
Utilisez une pipette pour enlever le supernatant résiduel. Resuspendez la pastille en un millilitre de SCT et transférez le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse. Centrifugeuse à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse frais et précipiter à nouveau en ajoutant 1/6e volume de 20% de polyéthylène glycol et 2,5 chlorure de sodium molaire. Incuber sur la glace pendant 15 à 60 minutes. Ensuite, centrifugeuse à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Jetez à nouveau le supernatant et la centrifugeuse dans les mêmes conditions. Utilisez une pipette pour enlever le supernatant résiduel. Resuspendez la pastille dans 200 microlitres de SCT et de centrifugeuse pendant une minute supplémentaire pour éliminer les impuretés.
Ensuite, transférez le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse frais pour obtenir l’élitiste amplifié. Dans cette étude, le nombre d’entrées de phages est maintenu inchangé tandis que la concentration de revêtement de la protéine FGFR2 est progressivement réduite. Les résultats du titer de phage suggèrent que le nombre de phages récupérés augmente graduellement et qu’après trois tours, il y a une augmentation de 65 fois par rapport à celle du premier tour.
Une expérience ITC est ensuite menée pour mesurer l’affinité du petit peptide avec FGFR2. Les résultats indiquent que le peptide SP1 a une forte affinité avec FGFR2. Ces données démontrent l’efficacité du protocole de dépistage.
Pour étudier l’activité biologique du peptide SP1, un essai de prolifération de fibroblaste est effectué à l’aide d’un kit CCK-8. Balb/C3T3 sont incubés avec le peptide SP1 à différentes concentrations. Les résultats suggèrent que le peptide SP1 supprime la croissance des cellules.
La contamination par des phages de type sauvage doit être évitée ici. Assurez-vous d’utiliser des pointes de pipette résistantes aux aérosols. Alors que la croissance en obtenant l’amplification des phages.
Cette procédure peut également être utilisée dans le criblage de petits peptides qui se lient aux glucides, aux cellules de culture et aux tissus. Ces peptides peuvent être encore amplifiés par rapport au diagnostic et ciblés
