Le but de cet article est de fournir un protocole visuel détaillé et étapewise pour extraire des métabolites aqueux des cellules cancéreuses cultureneuses pour l’analyse suivante de métabolome. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité et sa fiabilité pour extraire les métabolites des cellules adhérentes. Mais surtout, il est bien optimisé pour l’analyse des métabolomes à l’aide de spectrométrie capillaire électrophoresis-masse ou CEMS.
La métabolomique est une technique puissante pour identifier les biomarqueurs ou détecter le cancer à un stade précoce et prédire la réponse de la chimiothérapie aux patients atteints de cancer. Nous utilisons des cellules cancéreuses dans cette démonstration. Cependant, cette technique peut également être appliquée pour récolter des métabolites d’autres cellules adhérentes telles que les fibroblastes dans les cellules iPS.
Les concentrations de métabolites sont normalisées en fonction du nombre de cellules viables. Une préparation si minutieuse de la culture, c’est la clé pour obtenir de bonnes données reproductibles. Ami Maruyama, technicien de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer, plaque HCC827 et PC-9 cellules dans des plats de 100 millimètres contenant 10 millilitres de RPMI-1640 moyen complété par 10% sérum bovin fœtal. Placez les plats dans un incubateur à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures à la culture. Après l’incubation, inclinez doucement les plats de culture de 100 millimètres pour aspirer le média de culture cellulaire.
Laver les cellules de chaque plat à l’aide de deux millilitres de solution saline tamponnée de phosphate sans calcium et magnésium. Secouez doucement chaque plat de sorte que la solution PBS couvre complètement la surface du plat, puis inclinez la vaisselle pour aspirer le tampon de lavage. Chaud 0,25%trypsine-EDTA solution à 37 degrés Celsius.
Avec une pipette sérologique de cinq millilitres, ajouter deux millilitres de la solution trypsine-EDTA réchauffée à chaque plat. Bercer délicatement chaque plat de sorte que la trypsine recouvre complètement la surface du plat. Incuber les plats de culture à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes.
Ajouter ensuite quatre millilitres de milieu de croissance complet préchauffé à chaque plat. Et pipette doucement plusieurs fois pour re-suspendre les cellules à moyen. Transférer chaque suspension cellulaire dans un tube conique séparé de 15 millilitres.
Centrifugeuse à 800 fois g pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et suspendez chaque granulé cellulaire en deux millilitres du milieu de croissance complet préchauffé. Mélangez 10 microlitres de la suspension cellulaire avec 10 microlitres de solution bleue trypan de 0,4 %, dans un microtube de 1,5 millilitre.
Chargez 10 microlitres du mélange dans une chambre de comptage cellulaire glisser à travers l’action capillaire. Insérez la glissière de chambre dans le compteur de cellules automatisé et appuyez sur le bouton de capture pour capturer l’image et afficher les résultats du nombre total et de la viabilité en pourcentage des cellules. Si le nombre total de cellules est supérieur à 0,5 million de cellules par millilitre, ajouter un autre milieu de croissance au tube conique de 15 millilitres pour obtenir la concentration cellulaire désirée.
Maintenant, ajoutez deux à cinq millilitres de la culture à chaque plat de culture cellulaire de 100 millimètres pour ensemencer approximativement un à deux 1/2 million de cellules par plat. Incuber les plats de culture en 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Tout d’abord, dans un flacon volumétrique de 15 millilitres, diluer une solution standard interne commerciale contenant du sulfone L-Methionine et de l’acide sulfonique D-Camphor-10 10 fois dans de l’eau ultrapure.
Dissoudre le mannitol dans de l’eau ultrapure pour préparer une solution de mannitol de 0,05 gramme par millilitre dans de l’eau ultrapure comme tampon de lavage. Puis, dans la tasse filtrante de chaque unité de filtre centrifuge, pipette 250 microlitres d’eau ultrapure. Capuchon les unités de filtre étroitement, et centrifugeuse à 9, 100 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Vérifiez le volume de chaque filtrate. Si un filtrate important s’est accumulé au cours de la première rotation courte, l’unité de filtre peut être défectueuse. Jetez l’unité de filtre et utilisez plutôt une nouvelle unité de filtre.
Fermez les couvercles des unités de filtre hermétiquement et centrifugez à nouveau à 9, 100 fois g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’eau ultrapure dans l’une ou l’autre des tasses filtrante et retirez l’eau ultrapure filtrée dans chaque tube de collecte à l’l’huile de pipette. Remettre les gobelets filtrants dans leurs tubes de collecte et utiliser les unités de filtre centrifuge dans l’heure qui suit pour éviter les dommages lors du séchage.
Sortez les plats de culture de 100 millimètres de l’incubateur et aspirez le milieu de culture cellulaire de chaque plat. Ajouter 10 millilitres de milieu de culture PBS avec ou sans diamide micromolaire à chaque plat, en prenant soin de ne pas perturber la couche cellulaire. Incuber les plats de culture à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Après incubation, aspirer le milieu de culture cellulaire de chaque plat de culture de 100 millimètres. Inclinez légèrement le plat, et ajoutez doucement deux millilitres de tampon de lavage de 5% de mannitol au bord de chaque plat pour laver les cellules, en prenant soin de ne pas déranger la couche cellulaire. Aspirez le tampon de lavage de chaque plat de culture, et lavez les cellules à nouveau en inclinant légèrement le plat et en ajoutant doucement 10 millilitres de tampon de lavage par plat.
Ensuite, aspirez complètement le tampon de lavage du bord de chaque plat de culture. Maintenant, ajoutez 800 microlitres de 99,7% de méthanol par plat de culture, et secouez doucement chaque plat de culture d’avant en arrière, pour couvrir toute sa surface. Laisser la vaisselle à température ambiante pendant 30 secondes.
Ajouter lentement 550 microlitres de la solution standard interne diluée par plat en immergeant la pointe de la pipette dans le méthanol et en pipetting doucement de haut en bas, plusieurs fois. Bercer délicatement chaque plat de culture d’avant en arrière pour couvrir toute sa surface et laisser les plats à température ambiante pendant 30 secondes. Ensuite, transférez la solution extraite de chaque plat de culture dans un tube de microcentrifugeuse séparé de 1,5 millilitre.
Centrifuger les tubes à 2300 fois g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Transférer 700 microlitres de chaque supernatant en deux unités de filtre centrifuge, avec 350 microlitres par unité. Centrifuger les tubes filtrants à 9 100 g à quatre degrés Celsius pendant environ deux heures, jusqu’à ce qu’aucun liquide ne reste dans les gobelets filtrants.
Retirer les gobelets filtrants et fermer hermétiquement les couvercles des tubes de collecte. Dans cette étude, les cellules HCC827 et PC-9 se sont développées également pendant trois heures. L’analyse cems indique la différence entre les cellules diamide-traitées et les cellules PBS-traitées pour les deux lignes cellulaires.
Parmi ceux-ci, plusieurs intermédiaires dans la voie de phosphate de pentose et dans la glycolyse supérieure étaient sensiblement plus élevés dans les conditions diamide-traitées, tandis que quelques intermédiaires tricarboxylic de cycle étaient inférieurs dans les conditions traitées. Les profils de métabolome des métabolites intracellulaires ont indiqué 175 et 150 métabolites différentiels dans HCC827 et PC-9 cellules, respectivement. Après traitement diamide, le niveau d’acide gluconique et de glucose oxydé a été multiplié par 12 dans les cellules HCC827 et 10 fois dans les cellules PC-9.
De même, le niveau de glucose 6-phosphate, un glucose phosphorylated dans le premier produit de glycolyse hexokinase-catalysé, a également augmenté 6.3- et 3.5-fois dans les cellules HCC827 et PC-9, respectivement. En outre, les niveaux de 6-phosphogluconate, le premier intermédiaire dans la voie de phosphate de pentose, ont augmenté considérablement 89 fois dans les cellules HCC827 et 231 fois dans les cellules PC-9. En revanche, les niveaux d’autres intermédiaires glycolytiques tels que le fructose 6-phosphate n’ont pas changé dans l’état expérimental de diamide.
Les niveaux totaux de phosphate d’adénone d’adénone de nicotinamide étaient presque équivalents entre le traitement de diamide et les conditions de contrôle de PBS. L’utilisation de la solution 5% mannitol, autre que PBS, comme tampon de lavage pour les cellules de lavage est très important pour l’analyse CEMS, parce que les tampons à base de sel interférer avec l’analyse et nuire à la mesure. Ce protocole n’est pas approprié pour extraire des métabolites hydrophobes comme les lipides, nous devons donc développer un protocole pour extraire commodément les métabolites hydrophiles et hydrophobes pour une analyse métabolome plus complète.
Cette technique réalise une extraction facile des métabolites de presque toutes les cellules adhérentes, et donc, est applicable pour une variété de recherches telles que le cancer, les cellules souches, la pharmacologie, la nutrition et la science cosmétique.
