Le tissu adipeux périvasculaire entoure les vaisseaux sanguins et régule la physiologie cardiovasculaire. Ce protocole est utilisé pour répondre à des questions clés liées à la fonction des progéniteurs adipeux humains dans le microenvironnement vasculaire. Les cellules progénitrices adipeuses varient en fonction de leur emplacement anatomique.
Nous montrons qu’une population d’progéniteurs multipotents peut être dérivée avec succès du tissu adipeux périvasculaire des patients présentant la maladie cardio-vasculaire. Spencer Scott, étudiant en médecine de mon laboratoire, démontrera l’intervention. Obtenez un morceau de 500 milligrammes de tissu adipeux perivasculaire humain ou PVAT de la salle d’opération tel que décrit dans le protocole de texte.
Transférez le PVAT humain frais du DMEM à un tube conique de 50 millilitres contenant 25 millilitres de solution antibiotique. Incuber avec le basculement pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Alors que le PVAT est dans la solution antibiotique, décongeler un aliquot de tampon de dissociation à 37 degrés Celsius.
Ajouter 50 microlitres de solution antibiotique/antimycotique 100x à cinq millilitres de tampon de dissociation et stériliser à l’aide d’un filtre à seringues de 0,22 micron. Ajouter un millilitre de solution de gélatine à un puits d’une assiette de 24 puits. Dans un capot d’écoulement laminaire, utilisez des forceps et des ciseaux stériles pour transférer le PVAT de la solution antibiotique à une boîte de Pétri stérile.
Ajouter un millilitre de tampon de dissociation préchauffé au tissu. Hacher finement l’ensemble du tissu en boue à l’aide de forceps stériles et de ciseaux de dissection. Transférer le lisier d’un millilitre à quatre millilitres de tampon de dissociation.
Incuber le tube sur le côté dans un shaker orbital préchauffé de 37 degrés Celsius à 200 rpm pendant une heure. Après une heure, aucun tissu visible ne doit être présent et la solution apparaîtra comme une suspension cellulaire trouble. Filtrer la solution à l’aide d’une passoire cellulaire de 70 microns réglée au sommet d’un tube conique de 50 millilitres.
Rincez la passoire avec 10 millilitres supplémentaires de solution antibiotique pour capturer autant de cellules que possible. Ne pressez pas la passoire. Maintenant pelleter les cellules pendant 12 minutes à 300 fois g dans une centrifugeuse balançant seau.
Après centrifugation, le tube sera séparé en une couche supérieure grasse d’adipocytes, une interphase et une pastille. La pastille est la fraction vasculaire stromale contenant des cellules endothéliales, des cellules immunitaires, des cellules sanguines et des cellules progénitrices. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de HBSS et de centrifugeuse pendant cinq minutes à 300 fois g.
Répétez cette étape pour un total de deux lavages dans HBSS. Aspirez maintenant la gélatine d’une assiette de 24 puits. Lavez doucement le puits une fois avec hbss pour enlever la gélatine non lié.
Resuspendez la pastille vasculaire stromal de fraction avec les globules rouges intacts dans un millilitre de milieu de croissance et la graine sur le puits gélatine-enduit. Ajoutez ensuite le FGF2 humain à une concentration finale de 25 nanogrammes par millilitre dans le milieu de culture. Incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2.
Après avoir fait pousser les cellules pendant 24 heures, retirez les supports de croissance et lavez les cellules cinq fois avec HBSS. Cette étape de lavage élimine les globules rouges et les cellules mortes. Ajouter ensuite un millilitre de crème fraîche complétée par 25 nanogrammes par millilitre de FGF2 à chaque puits.
Changez le média toutes les 48 heures en vous assurant de compléter avec 25 nanogrammes par millilitre de FGF2 frais à chaque fois. Cellules de passage une fois qu’elles atteignent 100% confluent sept à dix jours après l’explantation. Pour ce faire, aspirez les supports de croissance et lavez le monocouche deux fois avec un millilitre HBSS.
Aspirez tout HBSS des puits et ajoutez quelques gouttes de solution de dissociation cellulaire. Appuyez et faites tourbillonner la plaque plusieurs fois et incubez à 37 degrés Celsius avec 5% de CO2 pendant cinq à sept minutes pour soulever les cellules. Ajouter ensuite environ un millilitre de milieu de culture frais aux cellules détachées.
Distribuez 500 microlitres des cellules détachées à deux puits d’une plaque de 24 puits contenant chacun 500 microlitres de supports de croissance et 25 nanogrammes de FGF2. En outre, culture de la moelle osseuse humaine Cellules souches mésenchymales ou colonies MSC tel que décrit dans le protocole texte. Plaquez les nombres appropriés de cellules dérivées de la moelle osseuse et du PVAT par puits d’une plaque de 12 puits.
Pour les conditions adipogènes et ostéogéniques, plaquez environ 200 000 à 225 000 cellules par puits. Alors que pour les conditions chondrogenic, plaque 150.000 à 175.000 cellules par puits. Dissociez ensuite les cellules de la population humaine de cellules progénitrices PVAT et de la population humaine de MSC de moelle osseuse en ajoutant la solution de détachement cellulaire.
Incuber les cellules dans la solution de détachement à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 pendant cinq minutes. Tirez les populations dans des flacons coniques distincts de 15 millilitres. Faites tourner les flacons vers le bas à 500 fois g pendant sept minutes pour pelleter les cellules.
Puis résuspendez les cellules en un millilitre de PBS et utilisez un hémocytomètre pour estimer le nombre de cellules. Plaquez les cellules dans des plats de 12 puits comme avant. Fournir des plats séparés pour les conditions adogènes et ostéogéniques induites et non induites.
Et ajouter 1,5 millilitres de supports de conduction adpogénique et ostéogénique à chaque puits de la condition induite. Ajoutez ensuite 1,5 millilitres de supports adpogéniques et ostéogènes non induction à chaque puits de la condition non induite. Commencer l’incubation des populations cellulaires induites et non induites par l’adipogenic et ostéogénique à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.
Faites tourner le volume restant des cellules progénitrices humaines de PVAT et des MSCs humains de moelle pendant sept minutes à 500 fois g. Déterminez le volume nécessaire pour résuspendre le reste de la moelle osseuse et les granulés cellulaires dérivés du PVAT pour atteindre une densité de 100 000 cellules par 10 microlitres. Puis réutilisez les granulés dans le volume calculé du média de croissance MSC pour l’induction de lignée chondrogenic.
Déplacez doucement le volume de cellules de haut en bas à l’aide d’une pipette pour assurer une distribution homogène. Maintenant pipette une gouttelette de 10 microlitres de la solution cellulaire concentrée au centre de chaque puits pour former une micro masse de 100 000 cellules. Placez un millilitre d’eau stérile dans le puits adjacent pour éviter l’évaporation.
Incuber les cultures de micro-masse pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5% de CO2 pour permettre à la micro-masse de s’agréger. Après deux heures, ajouter soigneusement les médias de différenciation chondrogenic piqués avec 10 nanogrammes par millilitre humain TGF-bêta-un à chacun des puits induits d’état. Maintenant, ajoutez soigneusement 1,5 millilitres du média de non-induction aux puits de condition non induits.
Racler ou verser la micro-masse dans l’état chondrogenic induit dans une cassette afin de déshydrater, intégrer et tacher l’échantillon tel que décrit dans le protocole de texte. Des études de différenciation adipogène ont été réalisées en parallèle avec des cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse humaine et des cellules progénitrices dérivées de la PVAT. Dans l’état non induit, aucune accumulation lipidique n’est évidente.
Ceci est en contraste avec la condition induite montrée après coloration des lipides neutres avec l’O.While rouge d’huile tandis que le degré de différenciation dans les cellules aortiques humaines PVAT-dérivées est plus robuste, les deux sources humaines de cellules ont montré la capacité de différencier pour la lignée adipogène. Le protocole de différenciation ostéogénique a été utilisé pour les MSCs dérivés de la moelle osseuse humaine et les cellules dérivées du PVAT. Les cellules non induites n’ont pas tache avec Alizarin Red.
Après le protocole ostéogénique de différenciation, les MSCs humains ont développé des nodules calcifiés qui ont souillé avec Alizarin Rouge tandis que les cellules humaines aortiques de PVAT n’ont pas. Les cellules dérivées des MSCs humains de moelle et du PVAT humain ont montré des dispositifs caractéristiques de la différenciation chondrogenic avec l’accumulation abondante de collagène dans la masse micro. La micro masse est formée des MSCs humains de moelle et des cellules aortiques PVAT-dérivées ont également exhibé l’accumulation abondante des glycosaminoglycans comme indiqué par la coloration bleue alcienne.
Morphologiquement, des structures semblables aux lacunes ont été détectées avec des cellules se reposant dans des cavités entourées par le dépôt de collagène. Il est essentiel de hacher finement le tissu adipeux périvasculaire avant la dissociation enzymatique et de s’assurer que les densités cellulaires appropriées sont plaquées pour chaque analyse de différenciation de lignée. Après cette procédure, le PCR quantitatif combiné avec la cytométrie occidentale de tache et de flux devrait être employé pour caractériser des marqueurs lineage-spécifiques des progéniteurs différenciés des sources périivasculaires d’adipose et de moelle.
Avec cette technique, nous pouvons commencer à comprendre les mécanismes régulant l’expansion et le dysfonctionnement adipeux perivascular de tissu pendant l’obésité et les implications que les cellules progénitrices ont sur la fonction vasculaire et la maladie cardio-vasculaire.
