Notre protocole aide les scientifiques à analyser le réseau d’actomyosine subcellulaire dans les cellules épithéliales individuelles et leur permet également d’effectuer une analyse similaire à l’échelle multicellulaire dans les tissus épithéliales incurvés. Notre protocole est un bel exemple d’une application fidjienne. Il dispose d’une interface utilisateur graphique intuitive, et il ne nécessite aucune connaissance du script.
Par conséquent, il est très approprié aussi pour les utilisateurs novices dans le domaine. Bien que notre méthode ait été développée pour les chambres d’oeufs de Drosophila, elle est également applicable en dehors de l’épithélie de Drosophila. Nous encourageons les scientifiques à tester notre protocole dans leurs systèmes modèles.
Utilisez les fichiers de test accompagnés pour vous familiariser avec ce protocole. Il vous aidera à décider quelle partie de ce protocole convient à votre question de recherche individuelle. Cette partie du protocole permet aux utilisateurs de segmenter les cellules épithéliales dans des films en accéléré et d’analyser par la suite les impulsions d’actomyosine dans les cellules individuelles au fil du temps à l’aide du Gestionnaire de surface.
Pour commencer, ouvrez Fidji et importez la macro TissueCellSegmentMovie. ijm tel que décrit dans le protocole texte qui l’accompagne. Ensuite, ouvrez un fichier TIFF corrigé à l’eau de Javel, et divisez les canaux du fichier corrigé à l’eau de Javel en allant à la barre de menu, en sélectionnant l’image, suivie de la couleur, et en sélectionnant les canaux fractionnants.
Exécutez le script téléchargé sur le canal de membrane cellulaire active du film sélectionné time-lapse en appuyant sur l’icône Exécuter dans le script ouvert. Afin d’obtenir un masque cellulaire agréable, réglez le flou gaussien à 2.500 et la sensibilité de détection cellulaire à moins un, et cliquez sur OK. Ensuite, réglez la tolérance au bruit estimée entre 10 et 20 pour les films time-lapse acquis avec l’objectif 63x, et cliquez sur OK. Un masque cellulaire généré apparaît dans le film time-lapse analysé, une nouvelle fenêtre appelée ParticleStack apparaît, et une petite fenêtre appelée Action Required apparaît également. À partir du masque cellulaire sur le film time-lapse, concentrez-vous uniquement sur les cellules au centre, et sélectionnez celles qui peuvent fournir des contours complets et bien définis tout au long du film time-lapse.
Lorsque les cellules sélectionnées au centre correspondent bien aux membranes cellulaires réelles, enregistrer ParticleStack comme un fichier TIFF. Ouvrez le fichier ParticleStack TIFF correspondant aux Fidji. Avec le plugin Surface Manager installé aux Fidji, ouvrez le plugin.
Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton d’image Lire le contour et réglez l’index Jaccard à 60%Le chargement des contours peut prendre plusieurs minutes en fonction du nombre de cellules. Une fois chargée, chaque cellule se voit attribuer un numéro S et apparaît dans la partie gauche de la fenêtre Surface Manager. Cliquez sur le numéro S sélectionné afin que la cellule importée contour de ParticleStack1.
tiff apparaît sur le film time-lapse. Vérifiez chaque numéro S importé pour la qualité des contours cellulaires tout au long du film, et supprimez les cellules indésirables qui affichent des contours cellulaires incorrects. Pour supprimer une cellule indésirable, mettez en surbrillance le contour de la cellule et cliquez sur le bouton Supprimer.
Utilisez l’outil Brosse pour corriger les contours des cellules. Une fois terminé, enregistrer les cellules corrigées comme un RoiSet. fichier zip.
Pour identifier si les impulsions d’actomyosine sont présentes dans le tissu analysé et pour comprendre le comportement détaillé, aussi bien que la directionnalité des signaux d’actomyosin, commencez par ouvrir Fidji. Ouvrez un film en accéléré, chargez le ParticleStack1 enregistré. masque de cellule tiff et le film time-lapse corrigé à l’eau de Javel, puis charger le plugin Surface Manager et la région d’intérêt correspondante de la RoiSet.
fichier zip. Ensuite, dans Surface Manager, activez un canal avec des signaux d’intérêt. Cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir la fenêtre appelée Tranche de valeur grise moyenne par tranche.
Les intensités moyennes et médianes des signaux d’actomyosine seront affichées au fil du temps dans des unités arbitraires, ainsi que d’autres paramètres liés à la zone et à la forme de la cellule. Enregistrez les valeurs en tant que fichier de feuille de calcul en vous rendant à la fenêtre Statistiques, en cliquant sur Fichier et en sélectionnant Save As.Similarly, générez un masque cellulaire et chargez-le dans Surface Manager afin d’analyser les impulsions d’actomyosine à l’échelle des tissus. Cette partie du protocole permet aux utilisateurs d’extraire sélectivement une fine couche d’actomyosine dans le tissu épithélial incurvé au fil du temps.
Ces étapes sont conviviales et basées sur une interface graphique intuitive. Ouvrez Fidji et assurez-vous que le plugin Ellipsoid Surface Projection est installé. Ensuite, ouvrez un film en accéléré et exportez-le sous la forme d’un fichier XML/HDF5 en cliquant sur Plugins, en allant à BigDataViewer et en sélectionnant l’image actuelle d’exportation sous forme de fichier XML/HDF5.
Ensuite, ouvrez le fichier exporté dans Ellipsoid Surface Projection en allant à Plugins, en cliquant sur BigDataViewer, suivi par Ellipsoid Surface Projection, et en sélectionnant le fichier XML. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre avec des vues sagittales de la chambre d’oeufs, et un dialogue pour guider l’utilisateur à travers le traitement apparaîtra. La fenêtre de dialogue, appelée Ovaries Projection, a plusieurs onglets.
Dans le premier onglet de dialogue, appelé boîte bondissante, définissez les bordures x et y d’une chambre d’oeufs dans le film time-lapse avec la largeur z de la boîte de dingage, et appuyez sur ensemble. Les parties sélectionnées de la chambre d’oeufs sont mises en surbrillance en rose. Ensuite, définissez la taille des blobs de signal dans l’onglet de dialogue appelé trouver des blobs dans la fenêtre de projection ovaries.
Définissez le sigma et la valeur maximale minimale. Ensuite, appuyez sur calculer pour identifier les signaux actomyosin, qui apparaîtra comme des blobs verts. Réessayez cette étape avec différents paramètres jusqu’à ce qu’environ 100 taches soient trouvées.
L’identification des signaux d’actomyosine est une étape cruciale. Cela dépend de la qualité du signal et de la taille correcte des blobs détectés. S’il n’y a pas de taches vertes visibles dans l’image, alors l’étape suivante ne fonctionnera pas.
Pour concevoir l’ellipsoide, continuer avec l’onglet appelé ellipsoid ajustement. Réglez des échantillons aléatoires à 10 000, la distance de coupure entre l’extérieur et l’intérieur à un à 10, puis cliquez sur calculer. Après cela, l’onglet appelé projection s’ouvrira automatiquement et permet la définition de l’extraction de surface.
Dans l’onglet projection, configurer une distance de projection minimale et maximale comme largeur de l’ellipsoide désiré. La distance de projection minimale et maximale doit s’adapter de sorte que la région ellipsoide définie rose inclut la couche extérieure entière de la chambre d’oeuf. Ensuite, définissez la distance de tranche comme une seule.
Assurez-vous que la région rose de l’ellipsoide avec le défini avec sur la chambre d’oeuf est visible avant de presser calculer. Il aide à évaluer la qualité d’un nouvel ajustement ellipsoid. Ensuite, réglez une largeur de sortie de l’ellipsoide à plus ou égale à 800 et une hauteur qui est supérieure ou égale à 400.
Ensuite, définissez la durée de l’extraction de surface et choisissez soit une projection sphérique, soit une projection cylindrique. Si nécessaire, retournez Z et alignez le calcul Y.Press pour obtenir une extraction de surface pour les deux canaux dans de nouvelles fenêtres appelées image. Ajustez la luminosité et le contraste des fenêtres d’image obtenues pour pouvoir voir les signaux d’actomyosine projetés en cliquant sur l’image, en allant ajuster et en sélectionnant luminosité/contraste.
Si l’extraction de surface semble bonne, enregistrez les deux canaux séparément sous forme de fichiers TIFF. En outre, enregistrez le fichier fenêtre Log pour référence future quant à la façon dont la surface de cette chambre d’oeufs particulière a été extraite. Ensuite, fusionnez les canaux avec un code couleur préféré aux Fidji, et enregistrez les résultats sous forme de fichiers TIFF.
Ce protocole permet aux scientifiques d’étudier le comportement des réseaux d’actomyosine dans les tissus épithéliales. Ceci n’est possible que lorsqu’une analyse détaillée du comportement de l’actomyosine à l’échelle cellulaire locale est combinée avec une analyse similaire à l’échelle des tissus. On y voit des exemples représentatifs du comportement dynamique de la myosine II à l’échelle cellulaire locale et à l’échelle des tissus pour le contrôle et la graisse2 mutantes chambres d’oeufs Drosophila.
Sur le plan basal unique, la chaîne de lumière réglementaire verte modifiée des signaux myosine II se déplace perpendiculairement à l’axe antérieur-postérieur des chambres d’oeufs de contrôle. Cette polarité est perdue dans les chambres d’oeufs mutantes fat2 et conduit à des impulsions anisotropiques de myosine II, oscillations Au niveau des tissus, la chaîne de lumière réglementaire verte modifiée de la myosine II dans l’échantillon de contrôle génère la force synchronisée nécessaire pour promouvoir la rotation épithéliale. En revanche, l’épithélium follicule d’une impulsion de chambre d’oeuf mutante fat2 fortement sur le côté basal et ne parvient pas à générer la force synchronisée nécessaire pour favoriser la rotation épithéliale.
Dans une région apical mince de la chambre d’oeuf de Drosophila, le mutant fat2 présente également avec le comportement dynamique modifié de la chaîne de lumière réglementaire modifiée verte de myosin II.After regardant cette vidéo, vous devriez avoir une bonne idée de la façon d’analyser un réseau d’actomyosine à l’échelle locale et tissulaire dans les chambres d’oeufs de Drosophila utilisant Fidji. Pour plus de conseils pratiques et de dépannage, s’il vous plaît voir la partie discussion après le protocole. Si vous avez des questions liées aux Fidji ou à nos plugins, consultez les pages Web respectives ou contactez-nous.
