Cette méthode peut répondre à des questions clés sur le phénotype du patch de souris Peyer isolé sous-ensembles de cellules T et B. En particulier, l’aide folliculaire T et les populations de cellules B du centre germinal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle dispense de plusieurs étapes laborieuses de préparation telles que la digestion basée sur le collagène qui compromettent la qualité et l’identité des lymphocytes isolés.
Commencez par placer une souris dans la position supine et stériliser l’abdomen avec 70% d’éthanol. Faire une incision abdominale de midline à travers la peau et le péritoine du pubis à la cage thoracique pour ouvrir la cavité péritineal et localiser le cécu et la jonction ileocecal. Faire aussi distal que possible couper à la jonction pour séparer l’intestin grêle de la ccum.
Couper la mesenterie avec des ciseaux pour enlever soigneusement l’intestin grêle entier jusqu’au sphincter pylorique. Couper la jonction entre le pylorus et le dudénome pour détacher complètement l’intestin grêle de la cavité abdominale et placer l’intestin grêle isolé dans un puits d’une plaque de 6 puits contenant le milieu froid de RPMI complété avec le sérum bovin foetal de 10%, ou FBS, sur la glace. Ensuite, agitez doucement les tissus manuellement jusqu’à ce que tous les segments soient immergés dans le milieu froid.
Lorsque tous les intestins ont été récoltés, utilisez des forceps pour saisir la graisse mésentérique d’un bord de l’intestin et placer l’échantillon, côté mésentérique vers le bas, sur une serviette en papier. Humidifier l’ensemble du segment intestinal avec RPMI 10%FBS pour éviter la déshydratation des tissus et la stickiness et localiser les patchs du Peyer, qui apparaissent comme des agrégats blancs multilobulés avec une forme de chou-fleur sur le côté anti-mésentérique de la paroi intestinale. Pour récolter les patchs du Peyer, utilisez des ciseaux chirurgicaux incurvés avec la courbe orientée vers le haut pour exciser doucement chaque patch de ses bordures distales et proximales, en prenant soin d’exclure le tissu intestinal environnant, et placez les patchs du Peyer dans les puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant du RPMI glacé 10% FBS sur la glace au fur et à mesure qu’ils sont recueillis.
Lorsque toutes les plaques ont été acquises, utilisez des ciseaux pour couper la pointe d’une pointe micro pipette de 1 millimètre de sorte que le diamètre est assez grand pour aspirer les patchs individuels de Peyer et transférer les patchs du Peyer en tubes coniques de 150 millimètres par souris contenant 25 millilitres de 37 degrés RPMI 10%FBS. Placez ensuite le tube dans un shaker orbital à 37 degrés Celsius avec agitation continue à 125-150 RPM pendant 10 minutes. À la fin de l’agitation, transférer les plaques du Peyer sur une passoire à cellules de 140 micromètres par souris, et utiliser l’extrémité en caoutchouc d’un piston de seringue de 10 millilitres par animal pour perturber doucement les taches du Peyer à travers le maillage en tubes coniques individuels de 50 millilitres.
Rincer les passoires avec 15-20 millilitres de RPMI froid 10%FBS et recueillir les cellules par centrifugation. Après avoir soigneusement jeté le supernatant, resuspendez les cellules à environ 1 fois 10 à la 7ème cellule par millilitre de concentration de RPMI 10%FBS pour le comptage. Puis transférer 2-2,5 fois 10 à la 6e cellule par 200 microlitres de milieu à chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 puits et pelleter les cellules par centrifugation.
Après avoir jeté le supernatant avec un léger scintillement, centrifugeuse laver les cellules en 200 microlitres de tampon debout. Étiquetez les cellules en 100 microlitres de colorant fixable, dilués dans un tampon sans protéines pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius, protégés de la lumière, suivis de 2 lavages et tampon de coloration fraîche. Après avoir jeté le supernatant, resuspendez les granulés dans 20 microlitres de bloc FC pendant 15 minutes d’incubation à 4 degrés Celsius, suivi de l’ajout de 80 microlitres de cocktail d’anticorps de surface primaire d’intérêt, pendant 30 minutes sur la glace, protégé de la lumière.
À la fin de l’incubation des anticorps de surface, centrifugeuse laver les cellules deux fois dans un volume excessif de tampon de coloration, et de resuspendre les granulés dans 100 microlitres de solution secondaire de coloration de surface, complétée par de la streptavidine. Après 15 minutes sur de la glace protégée de la lumière, centrifugeuse laver les cellules 2 fois dans le tampon de coloration fraîche et resuspendre les granulés dans 200 microlitres de fixation, solution de travail de permébation pour une incubation pas plus de 20 minutes sur la glace, protégé de la lumière. À la fin de l’incubation, la centrifugeuse de la plaque immédiatement, suivie d’une centrifugeuse était de 200 microlitres de tampon de permeablization par puits.
Ensuite, résuspendez les cellules dans 20 microlitres de bloc FC, dilués dans le tampon de permeablization comme démontré, suivi de l’ajout de 80 microlitres du cocktail intracellulaire d’anticorps d’intérêt, pendant 30 minutes à température ambiante, protégé de la lumière. Lavez les cellules avec 100 microlitres de tampon de permeablization, suivi d’un deuxième lavage dans 200 microlitres de tampon de permeablization. Ensuite, resuspendez les granulés dans 200 microlitres de tampon de coloration, et transférez les cellules aux tubes d’analyse cytométriques correspondants à débit de 5 millilitres appropriés, dans un volume final de 400 microlitres de tampon de coloration par tube.
Les taches de Peyer ne sont pas réparties uniformément dans l’intestin grêle, mais sont localisées plus densément vers les extrémités distales et proximales du tissu. Ce protocole facilite l’isolement d’une population de lymphocytes patch de Peyer qui démontre une distribution dispersée vers l’avant, semblable à celle observée pour les splenocytes, avec une viabilité cellulaire supérieure à 95%. Les cellules CD4 CD19 Double Positive représentent environ 1 % de la population totale de lymphocytes patch de Peyer.
Ceux-ci expriment des niveaux élevés de CXCR5 et GL7, qui, lorsqu’ils ne sont pas exclus, peuvent conduire à de faux résultats positifs dans le gating de T-helper folliculaire et germinal centre B cellule, respectivement. Comparés à d’autres organes lymphoïdes secondaires, les corrections de Peyer montrent un rapport sensiblement plus élevé des cellules B de centre germinal, à une gamme de 2-10%de la population totale de cellules de B dans des conditions stables d’état. Comme les cellules B du centre germinal, la fraction folliculaire des lymphocytes T-helper varie également chez les souris non immunisées individuelles, avec une fourchette de 10-20% du total, la population de lymphocytes T patch CD4 Positive Peyer.
La digestion enzymatique basée sur la collagène mène à la réduction massive de l’expression folliculaire de CXCR5 de T-helper de cellules, tout en laissant l’expression d’autres molécules de surface inchangées. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à l’identification des facteurs cellulaires clés dans les patchs de Peyer qui sont impliqués dans l’immunité muqueuse et humérale.
