Cette nouvelle méthodologie nous permet de construire des assemblages tridimensionnels, adaptés des cellules individuelles désirées, dans une solution tampon aqueuse contenant du polymère hydrophilique non spécifique, en établissant un contact cellule-cellule stable. Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment nous manipulons les cellules individuelles désirées et construisons des assemblages cellulaires 3D sans échafaudage artificiel. Ici, nous allons montrer la procédure expérimentale dans notre milieu avec Dextran comme exemple.
Pour commencer, maintenez les cellules épithéliales de glande mammaire de souris de NAMRU avec cinq millilitres de DMEM, contenant 10%FBS et 1%Penicillin-Streptomycin, dans un flacon de 25 centimètres cubes pendant deux à trois jours. Lorsque vous êtes prêt à procéder, utilisez un aspirateur pour enlever le DMEM complété et ajouter trois à cinq millilitres de PBS, qui est préchauffé à 37 degrés Celsius pour laver les cellules. À l’aide d’un aspirateur, retirer tout le PBS du flacon.
Ajouter 1,5 millilitres de trypsine préchauffé à 37 degrés Celsius. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius pendant au moins une à deux minutes. Après cela, ajouter 3,5 millilitres de DMEM contenant 10%FBS et 1%Pénicilline-Streptomycine.
Pipette de haut en bas pour mélanger. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et la centrifuger à 417 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Ensuite, aspirez le médium.
Ajouter cinq millimètres de DMEM frais contenant 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine. Et si nécessaire, utilisez une solution de cryopréservation pour cryopréserver les cellules comme indiqué par les instructions du fabricant. Premier mélange de 10 millilitres de DMEM complété par 10%FBS et 1%Penicillin-Streptomycin avec 0,8 grammes de Dextran, pour préparer une solution Dextran de 80 milligrammes par millilitre.
Mélangez 200 microlitres de cette solution Dextran avec 200 microlitres de la suspension cellulaire précédemment préparée, pour créer une suspension cellulaire contenant 40 milligrammes par millilitre de dextran moyen. Pour commencer, allumez le laser, notez que l’utilisation d’un faisceau laser avec une longueur d’onde dans la région rouge à proche infrarouge est plus efficace. Ensuite, ouvrez le logiciel en cliquant deux fois sur l’icône logicielle.
Double cliquez sur l’icône pour l’appareil photo et notez que l’affichage correspondant apparaîtra. Puis double clic sur les icônes pour la diode électroluminescente, la mise au point ajuster, et la scène en mouvement pour ouvrir leurs écrans ainsi. Placez d’abord deux entretentres en verre sur la glissière inférieure en verre de couverture.
Transférer 20 microlitres, la suspension cellulaire complétée Parxtran précédemment préparée sur la glissière en verre de couverture inférieure. Placez ensuite la glissière supérieure en verre sur les entretriers qui recouvrent la suspension cellulaire. Placez la cellule échantillonnée sur la lentille objective inférieure avec 10 microlitres d’eau distillée pour la microscopie d’immersion dans l’eau.
Fixez la lentille objective supérieure au sommet de la cellule de l’échantillon à l’aide de 10 microlitres d’eau distillée. Ensuite, cliquez sur le bouton on-off dans la fenêtre d’éclairage du microscope pour activer la LED. Cliquez sur les boutons de direction de la fenêtre de positionnement objectif pour ajuster la distance entre l’échantillon et l’objectif inférieur jusqu’à ce qu’il soit au point.
Réglez l’intensité de chaque faisceau laser à 1500 milliwatts dans la fenêtre d’atténuation du signal. Ensuite, cliquez sur les deux icônes laser pour irradier les faisceaux laser à la position un et la position deux. Cliquez sur les boutons directionnels de la fenêtre de positionnement de l’échantillon pour déplacer l’étape de l’échantillon jusqu’à ce qu’une cellule soit piégée à la première position.
Cliquez et faites glisser le curseur indiquant la position deux jusqu’à ce qu’une autre cellule soit piégée à la position deux. Pour commencer, manipulez une seule cellule, de sorte qu’elle soit en contact avec une autre cellule. Maintenez cette condition pendant 300 secondes, de sorte que la cellule est exposée à un laser pendant 300 secondes.
Enregistrez l’axe x-y. Piégeez une autre cellule et transportez-la vers les deux premières cellules pour construire un assemblage arbitraire de cellules 2D. Déplacez ensuite la scène de haut en bas pour construire un assemblage cellulaire 3D.
Confirmez que l’assemblage est toujours stable même après l’éteignement du laser. Dans cette étude, des polymères solubles sont utilisés dans la construction d’assemblages 3D à cellules simples. Une structure d’exemple formée à l’aide de la pince optique à double faisceau est montrée ici.
Si l’expérience est réussie, ces assemblages cellulaires restent stables même après l’éteignement du laser. Cette nouvelle méthodologie est pour la construction d’assemblages cellulaires 3D dans un milieu aqueux avec polymère hydrophilique naturel. On s’attend fortement à commencer la construction d’un tel type d’assemblages cellulaires de prochaine génération avec certains des outils puissants dans le domaine de la médecine régénérative et de l’ingénierie tissulaire.
