Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’architecture chromatine comme la façon dont la structure 3D de la chromatine peut influencer l’expression et le développement des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une vue haute résolution de l’architecture chromatine et des embryons volants mis en scène avec précision. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’organisation et du développement de la chromatine, on peut également utiliser les lignes existantes des bibliothèques de mouches transgéniques pour tester leur effet dans l’organisation de la chromatine.
Pour commencer le protocole, ajustez le volume total d’embryons précédemment recueillis à deux millilitres avec PBST. Ajouter six millilitres d’heptane et 100 microlitres de formaldéhyde à 37 % dans l’eau. Après avoir ajouté du formaldéhyde, secouez vigoureusement le tube de haut en bas pendant une minute.
La phase aqueuse et organique se combinera pour former une consistance de shampooing. Agiter le mélange sur un mélangeur rotatif pendant 10 minutes. Centrifuger le tube à 500 fois g pendant une minute à température ambiante pour recueillir les embryons au fond du tube.
Aspirez tout le liquide en forme de shampooing et jetez-le, en prenant soin de ne pas aspirer les embryons. 15 minutes après l’ajout de formaldéhyde, resuspendre les embryons en cinq millilitres de PBST avec 125 millimolaire glycine. Secouez vigoureusement les embryons de haut en bas pendant une minute.
Après centrifugage, aspirer le supernatant. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez un lot de 100 embryons dans un petit récipient en verre adapté au tri, de préférence sur un fond sombre et placez-le sur de la glace. Trier les embryons par densité nucléaire et par état du cycle cellulaire à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe de seringue.
Enlevez tous les embryons mitotiques reconnaissables par leur distribution dispersée et non nucléaire de l’EGFP PCNA et des embryons qui montrent partiellement un signal GFP non nucléaire. Pour faciliter le tri, alignez des embryons de référence aux cycles nucléaires 12, 13 et 14 dans chaque lot pour faire correspondre les embryons à l’un des embryons de référence. Pipette les embryons désirés à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres.
Transférez-les dans un tube frais et placez-les sur la glace. Continuer jusqu’à ce que suffisamment d’embryons soient triés pour l’expérience prévue. Faire tourner brièvement les tubes à 100 fois g à température ambiante.
Retirer le surnatant et s’assurer que les embryons sont aussi secs que possible pour la congélation. Congelez flash les embryons en vantant les tubes dans de l’azote liquide et stockez à moins 80 degrés Celsius. Déposer les tubes avec des embryons congelés sur la glace.
Resuspendez les embryons dans 500 microlitres de tampon de lyse glacée. Attendez une minute pour permettre à l’embryon de se déposer au fond du tube. Ensuite, moudre les embryons avec un micro pilon métallique pré-refroidi sur la glace qui est conçu pour s’adapter étroitement à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Pour éviter d’agiter les embryons, insérez le pilon lentement jusqu’à ce qu’il touche le fond du tube. Poussez vers le bas, puis moudre en tournant le pilon deux fois dans les deux directions. Soulevez très légèrement le pilon.
Poussez à nouveau au fond du tube et répétez la procédure de broyage 10 fois ou jusqu’à ce que les embryons soient complètement lysés. La solution doit être homogène et aucun gros embryon résiduel ne doit rester. Incuber la suspension homogénéisée sur la glace pendant 15 minutes.
Tournez à 1000 fois g quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille en réutilisant dans 500 microlitres tampon de lyse glacée et pipetting de haut en bas. Après un autre spin, jeter le surnatant.
Resuspendez la pastille lavée dans 100 microlitres de sulfate de dodecyl de sodium de 0,5 % ou SDS. Puis perméabiliser les noyaux en incubant l’échantillon pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Ajouter 50 microlitres de 10% Triton X100 et 120 microlitres d’eau.
Feuilleter le tube pour mélanger le contenu et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bloc thermique. Ajouter 25 microlitres de tampon d’enzyme de restriction 10X et 20 unités de cinq unités par microlitre MBO1. Feuilleter le tube pour mélanger le contenu et incuber le tube dans un bloc thermique pour digérer l’ADN.
Ajouter 20 autres unités de MBO1. Poursuivre l’incubation pendant 90 minutes. Après la deuxième incubation de 90 minutes, incuber l’échantillon à 62 degrés Celsius pendant 20 minutes pour inactiver le MBO1.
Ensuite, ajoutez 18 microlitres de biotine de 0,4 millimolaire 14-dATP, 2,25 microlitres d’un mélange d’ADN non modifié de 3,3 millimlaires DCTP-dGTP-dTTP, et huit microlitres de cinq unités par fragment d’ADN microliter I Klenow. Feuilleter le tube pour mélanger le contenu et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Ensuite, ajoutez 657 microlitres d’eau, 120 microlitres de tampon ligase d’ADN 10X T4, 100 microlitres de 10% Triton X100, six microlitres de 20 milligrammes par millilitre albumine de sérum bovin, et enfin cinq microlitres de cinq unités par microlitre T4 ligase d’ADN.
Ensuite, faites pivoter doucement le tube à 20 RPM à température ambiante pendant deux heures. Ajouter cinq autres microlitres de cinq unités par microlitre T4 ligase d’ADN. Continuez à tourner pendant deux heures de plus, puis faites tourner les noyaux à 2500 fois g pendant cinq minutes.
Après centrifugation, jeter le supernatant. Resuspendez la pastille en 500 microlitres de tampon d’extraction et ajoutez 20 microlitres de 20 milligrammes par millilitre proteinase K.Flick le tube et incuber le tube pour digérer la protéine. Ajouter 130 microlitres de cinq molaires de chlorure de sodium et incuber toute la nuit pour dé-croiser.
Le lendemain, pipette l’échantillon dans un nouveau tube de deux millilitres avec de faibles caractéristiques de liaison d’ADN. Ajouter 0,1 X de volume de trois acétate de sodium molaire et deux microlitres de 15 milligrammes par millilitre glycoblue. Ajouter 1,6 volume d’éthanol absolu pur et inverser le contenu, puis incuber l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.
Après l’incubation, centrifuger le contenu. Localisez la pastille d’ADN qui ne peut être repérée que par le GlycoBlue. Retirez soigneusement le surnatant, en déplaçant la pointe de pipette dans le tube le long du mur opposé de la pastille d’ADN.
Lavez la pastille avec 800 microlitres de 70% d’éthanol. Mélanger l’échantillon en l’inversant et en le centrifugant à 20 000 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez les gouttelettes restantes pendant cette étape et les lavages suivants en les poussant hors des tubes avec une pointe P10, puis ouvrez le couvercle pour sécher à l’air pendant jusqu’à cinq minutes.
Une fois qu’il ne reste plus de liquide, ajouter 50 microlitres de chlorure tris de 10 millimlaires. Pipette à plusieurs reprises la solution sur la zone où la pastille a été localisée pour solubiliser l’ADN. Ajouter un microlitre de 20 milligrammes par millilitre RNase A.Mix en faisant glisser le tube.
Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour digérer l’ARN. Enfin, conservez l’échantillon au congélateur ou au réfrigérateur jusqu’à la préparation de la bibliothèque. Les images du signal EGFP PCNA de chaque lot d’embryons triés révèlent des statuts précis du stade et du cycle cellulaire de chaque embryon pour des expériences en aval.
Les traces de bioanalyseurs montrent que la distribution de taille des fragments d’ADN après sélection de taille se situe entre 300 et 700 paires de base avec un maximum d’environ 450 paires de base. Les cartes d’interaction Hi-C montrent qu’au cycle nucléaire 12, peu de domaines associés topologically ou TADs sont détectés qui change considérablement aux cycles nucléaires 13 et 14 quand les TAD sont de plus en plus proéminents et les contacts à longue portée non spécifiques sont épuisés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de laver les perles à fond et de ne pas prolonger inutilement les temps d’incubation, surtout à des températures élevées, car cela peut conduire à des bibliothèques Hi-C de mauvaise qualité.
Cette technique combinant une mise en scène précise et une cartographie de confirmation de la chromatine à haute résolution a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique afin d’explorer le rôle de l’organisation tridimensionnelle de la chromatine dans un cadre développemental in vivo.
