Name: label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators
Uploaded: 2015-12-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
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This research was supported in part by a National Research Service Award (T32GM07616) from the National Institute of General Medical Sciences.

1. installation expérimentale et la préparation d&#39;échantillons <ol><li> Fabriquer microtoroids utilisant la lithographie, la gravure, et la fonte de la procédure comme décrit précédemment 6. Fabriquer microtoroids sur le dessus d&#39;une plaquette de silicium (puce) qui ont typiquement un diamètre majeur de 80 à 100 um, et un diamètre mineur de 2 um. </li><li> Se détendre à peu près un mètre de fibre optique monomode (125 um gaine, 4,3 um de diamètre de champ de mode) de sa bobine de fibre. </li><li> Au milieu de la partie déroulée de la fibre optique, la bande un petit segment (2,5 cm) de la couche de polymère autour de la fibre optique en utilisant une pince à dénuder. Note: Ceci est la partie de la fibre optique qui sera utilisé pour coupler la lumière évanescente dans le microtoroid. </li><li> Nettoyez la fibre dénudée avec de l&#39;alcool de l&#39;isopropanol et un non pelucheux lingette. </li><li> Maintenez cette partie de la fibre en place à l&#39;aide d&#39;un support de fibre fait de pinces magnétiques. </li><li> Diluer la fibre dénudée à ~ 500 nm par melting et en tirant à l&#39;aide d&#39;un chalumeau à hydrogène et moteurs pas à pas deux mobiles dans des directions opposées à 60 um / min. Placez la fibre optique à l&#39;intérieur de la partie supérieure de la flamme, qui devrait être ~ 10 mm de hauteur. Arrêter tirant sur la fibre lorsque la transmission à travers la fibre arrête fluctuant, qui peut être surveillée soit visuellement (en regardant la lumière qui est diffusée latéralement à partir du clignotement de fibres sur et en dehors) ou en connectant la fibre à une photodiode qui est fixé à un oscilloscope . </li><li> Cliver une extrémité de la fibre optique et l&#39;insérer dans un adaptateur de fibre nue. Placer cette extrémité de la fibre à l&#39;entrée du photo-récepteur. </li><li> Fibre coupler l&#39;autre extrémité de la bobine de fibre à l&#39;aide d&#39;un laser par le coupleur de fibre optique. </li><li> Placez la puce microtoroid sur un porte-échantillon (acier inoxydable, 37,8 mm x 6,4 mm x 3,2 mm) en utilisant soit époxy ou ruban adhésif double face. </li><li> Monter le porte-échantillon sur une platine de positionnement qui se compose d&#39;une nano 3 axes de positionnement (nanocube) stade (voir la liste d&#39;équipement) sur le dessus d&#39;un micromètre à 3 axes. Effectuer toutes les expériences sur une table optique pneumatique isolé pour minimiser les vibrations. </li><li> Position grossière de la puce de l&#39;échantillon en utilisant le micromètre à 3 axes. </li><li> Alignez les contenant microtoroid puce parallèle à la fibre optique en utilisant la nano-positionneur. Remarque: Aligner le microtoroid à une distance d&#39;une longueur d&#39;onde de la lumière d&#39;entrée (~ 633 nm). Pour la visualisation de ce processus utiliser deux colonnes d&#39;imagerie (tube avec objectif et la caméra objective, voir la liste de l&#39;équipement) positionnée sur le dessus et sur le côté de la puce. </li><li> Optimiser la polarisation de la lumière laser dirigé à travers la fibre optique en utilisant un contrôleur en ligne de polarisation (voir la liste d&#39;équipement) avec un bouton pour ajuster la polarisation. Remarque: la polarisation optimale est obtenue lorsque l&#39;inclinaison mesurée dans la transmission de la fibre optique apparaît le plus étroit. Observez cette trempette sur un oscilloscope (voir l&#39;étape 2.2 pour plus de détails). </li><li> Constructionune chambre d&#39;échantillon par epoxying une lamelle de verre sur la platine porte-échantillon en utilisant une lame de microscope en verre comme un écarteur. Remarque: Un boîtier en plexiglas couvrant l&#39;ensemble de la configuration peut être utile pour minimiser les courants d&#39;air. Une petite ouverture devrait être laissée à la solution pour permettre à pomper à l&#39;aide de tubes. </li><li> Équilibrer thermiquement suspensions de particules ou de solutions aqueuses d&#39;une seule molécule ≥ 1 heure dans un bain d&#39;eau RT (~ 500 ml). Note: Les échantillons sont dilués à la concentration désirée dans des microtubes en utilisant les tampons associés spécifiées par le fabricant, par exemple, PBS ou HEPES. Si aucun événement de liaison est détecté, augmenter la concentration en sel du tampon. </li><li> Vortex particule de solutions contenant (1 ml) pendant environ 2 brièvement sec. </li><li> Injecter des solutions contenant des particules dans la chambre d&#39;échantillon à 1 ml / min en utilisant une pompe à seringue de 1 ml. </li><li> Après la chambre de l&#39;échantillon a rempli, éteignez la pompe seringue. </li><li> Attendre 30 secondes avant que les données d&#39;enregistrement afin de minimiserles effets des vibrations mécaniques résultant de l&#39;écoulement de fluide qui peuvent affecter la mesure. </li></ol> 2. Serrure de fréquence <ol><li> Re-coupler le tore à la fibre optique par déplacement du porte-échantillon avec la nanopositionneur, parce que le couplage sera perturbé en raison de l&#39;injection de fluide. </li><li> Localiser la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid par le balayage laser d&#39;entrée commandé par ordinateur par le biais d&#39;une variété de longueurs d&#39;onde. Effectuer cette opération par l&#39;envoi d&#39;un signal de tension de forme d&#39;onde triangulaire à un élément piézo-électrique à l&#39;intérieur de l&#39;unité de commande laser qui régule la longueur d&#39;onde du laser. Effectuer des expériences en utilisant la lumière visible (635 nm ± 2,5 nm) car il est faible absorption de la lumière dans l&#39;eau à cette longueur d&#39;onde. </li><li> Mesure de la transmission de la lumière à travers la fibre optique en branchant la sortie de la fibre optique en un photorécepteur auto-équilibré. Branchez la sortie du photorécepteur en un oscilloscope à l&#39;aide d&#39;un câble BNC. Observer on l&#39;oscilloscope que la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid, la transmission à travers la fibre optique diminue. </li><li> Fixez la sortie du photorécepteur à l&#39;entrée principale du blocage contrôleur de rétroaction (voir la liste d&#39;équipement) via un câble fréquence. </li><li> Exécutez le contrôleur de rétroaction de verrouillage de fréquence en mode de verrouillage automatique à l&#39;aide de verrouillage avec une fréquence de vibration de 2 kHz et une amplitude de l&#39;oscillation de longueur d&#39;onde 19 fm pic haut de. Empiriquement définir les paramètres proportionnelle intégrale dérivés dans la fenêtre du logiciel en utilisant les règles de réglage de Ziegler-Nichols 14. Remarque: Ces valeurs doivent seulement être réglé une fois au début de toutes les expériences. </li><li> Auto-verrouiller la longueur d&#39;onde du laser à la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid. Effectuez cette étape après remplissage de la chambre d&#39;échantillon. Remarque: Si le changement de longueur d&#39;onde est trop grand, alors le contrôleur de rétroaction perdra serrure et passe automatiquement en mode de balayage afin de localiser l&#39;emplacement de longueur d&#39;onde de résonance. Cette occurs pour décale longueur d&#39;onde supérieure à environ une largeur de raie (au moins 600 FM pour tous les systèmes étudiés ici). </li><li> Enregistrez la sortie du contrôleur de rétroaction à 20 kHz en utilisant une carte d&#39;acquisition de données 24 bits. Exporter les données dans un fichier texte via le logiciel d&#39;acquisition de données. </li></ol> 3. Traitement des données et de l&#39;analyse <ol><li> Transformée de Fourier les données dans MATLAB. </li><li> Passe-bas les données à l&#39;aide d&#39;un &quot;mur de briques&quot; filtre avec une coupure à 1 kHz pour éliminer la fréquence de vibration imposée de 2 kHz (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 1). </li><li> Encoche calcul de filtrer les données en utilisant une taille de fenêtre de 16 Hz. Note: Ceci est fait pour éliminer les sources connues de bruit, dans ce cas, 60 Hz bruit de ligne électronique et ses harmoniques, ainsi 100 Hz (en venant du pilote laser) et ses harmoniques (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 1). </li><li> Transformée de Fourier inverse les données dans le domaine temporel. </li><li> Filtre médian les données en utilisant une fenêtretaille de 1001 échantillons (voir code supplémentaire Fichier d&#39;écran 2). </li><li> Repérez des changements progressifs dans la longueur d&#39;onde de résonance à l&#39;aide de l&#39;algorithme de recherche de l&#39;étape-Kerssemakers et al. 15. </li><li> Générer des histogrammes de l&#39;amplitude de chaque étape de liaison. </li><li> Calculer la taille des particules en utilisant l&#39;équation. (1) (voir la discussion). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Comme une particule se lie, la longueur d&#39;onde de résonance (λ) du tore augmente. Si une particule délie, la longueur d&#39;onde de résonance diminue en conséquence (un événement step-down). Le diamètre des particules (d) peut être déterminée par des histogrammes de l&#39;amplitude de chaque étape de longueurs d&#39;onde. La hauteur de chaque étape de la longueur d&#39;onde varie en raison de variations de la taille des particules lié et en raison de l&#39;emplacement sur le microtoroid où la particule se lie. La variation maximale en résonance longueur d&#39;onde (hauteur de l&#39;étape) se produit lorsque des particules se lient à l&#39;équateur de la microtoroid où le champ électrique (E 0, max) est un maximum. Cette hauteur de marche maximale (Δλ) est liée à un diamètre de particules à travers l&#39;équation. (1) 8, où a est le rayon de la particule, D est une constante diélectrique en fonction de l&#39;indice de réfraction de la particule et lié de ses milieux environnants, V m est le volume de mode de light dans le microtoroid déterminée par des simulations par éléments finis 2, et E 0 (r s) est l&#39;amplitude du champ électrique à l&#39;équateur de particules également déterminé par des simulations par éléments finis: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/53180/53180eq1.jpg" width="500" /> Inversion Eq. (1) indique que la puissance du signal (Δλ) évolue avec le volume des particules (3). Notre facteur diélectrique est défini comme suit: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/53180/53180eq2.jpg" width="150" /> où est l&#39;indice de réfraction du milieu environnant, et est l&#39;indice de réfraction de la particule. Estimations théoriques pour la taille des particules basé sur l&#39;équation (1) ainsi que Les histogrammes et la taille cal supplémentairescal- sont présentés dans 2, 16. FLOWER peut être modifié pour un suivi plus rapide, en augmentant la fréquence à laquelle le contrôleur de verrouillage de rétroaction fréquence suit la longueur d&#39;onde du microtoroid. La procédure de traitement de données peut être modifié en utilisant une moyenne mobile à la place d&#39;un filtre médian, et événements de liaison peut encore être récupéré, mais le filtre médian provoque bords étape pour être mieux préservées. Limites de cette technique comprennent le fait que le changement de longueur d&#39;onde de la microtoroid lors de la liaison des particules dépend où sur le résonateur terres des particules. Ainsi, la confirmation de la fixation d&#39;une seule particule repose sur la génération d&#39;un histogramme de nombreux événements de liaison discrètes. Si aucun événement de liaison distincts sont détectés, ce qui augmente la concentration en sel du solvant permet. L&#39;importance de cette technique en ce qui concerne les méthodes existantes est qu&#39;il n&#39;y a pas d&#39;étiquettes sont nécessaires pour interroger la molécule cible.La liaison sélective nécessite cependant la fonctionnalisation de la sonde avec des anticorps. D&#39;autres avantages comprennent le fait que, depuis microtoroid résonateurs ont des zones de capture de plus grandes par rapport aux méthodes de résonance de plasmon de surface à haute sensibilité, d&#39;événements de liaison des particules sont plus susceptibles de se produire. En outre, parce FLEUR ne nécessite pas de marqueurs fluorescents qui peuvent photobleach, fleur est capable de (&gt; 10 sec) des mesures de long avec rapide (milliseconde) résolution temporelle. Les étapes critiques au sein du protocole comprennent alignant le cône de fibre optique avec le microtoroid. Une fois le tore est immergé dans un liquide trop de mouvement de la fibre à travers le liquide, peut causer le cône de rompre, mettant ainsi fin à l&#39;expérience. FLEUR dans sa formulation actuelle ne convient donc pas pour des expériences sur l&#39;échelle de temps des heures. En outre, une fois le microtoroid a été immergé dans un liquide et des particules lier, le facteur de qualité (Q) tombe irrémédiablement sur une échelle de temps d&#39;heures et I crêterrouillage peut devenir instable. Dans cette situation, un nouveau dispositif est nécessaire. Parce que nous tergiversons notre fréquence du laser dans une très petite plage autour du pic de résonance, FLEUR ne scanne pas simultanément à travers le spectre de résonance et donc ne mesure pas les variations de facteur de qualité en temps réel sous forme de particules se lient. En regardant le facteur de qualité avant et après la liaison de seulement quelques particules, nous ne voyons pas une dégradation importante de facteur Q. Nous nous attendons à ce que c&#39;est parce que les tores vierges originales ont relativement faible facteur Q (Q chargé dans l&#39;eau de ~ 1x10 5 -5x10 6). Nous notons que le bruit de fluctuation induite par laser est soustraite à l&#39;aide du photorécepteur auto-équilibré. Nous minimisons les fluctuations de la fibre optique contre le tore en plaçant la fibre en contact direct l&#39;microtoroid. En outre, si les paramètres PID ne sont pas correctement définies, les fluctuations apparaîtront, à savoir, le système ne sera pas rapidement et ACCURATEly quarts de longueur d&#39;onde de la piste. Règles de réglage de Ziegler-Nichols peuvent être utilisés pour définir correctement le PID paramètres 14. En suivant les procédures décrites ici, il devrait être possible de détecter et de nanoparticules de taille allant de centaines de nanomètres jusqu&#39;à quelques nanomètres, y compris des molécules biologiques simples.

Des expériences simples de détection moléculaires sont utiles pour réduire la quantité d&#39;analyte utilisé dans des biocapteurs pour la détection précoce de la maladie, et pour examiner les propriétés fondamentales des molécules 3. Ces expériences sont généralement effectuées en utilisant des étiquettes, cependant, étiquettes ne sont pas toujours possible d&#39;obtenir pour une protéine particulière, augmenter le coût, peut perturber les événements à l&#39;étude, et peut être gênant, en particulier pour le temps réel sur le site des expériences ou point de service diagnostics de soins. L&#39;étalon-or actuel biocapteurs sans étiquette est la résonance plasmonique de surface 4, mais les systèmes de résonance de plasmon de surface commerciale ont généralement une limite inférieure de détection typique de l&#39;ordre de nM. Récemment, résonateurs optiques ont émergé comme une technologie prometteuse pour sans étiquette seule molécule biodétection 5. Résonateurs optiques travail basée sur le long terme (NS) confinement de la lumière 6,7. La lumière est évanescentecouplé dans ces dispositifs typiquement via une fibre optique. Lorsque la longueur d&#39;onde de la lumière passant par la fibre correspond à la longueur d&#39;onde de résonance du résonateur, la lumière efficacement couplé au résonateur. Ceci reflète la lumière couplée intérieurement totalement à l&#39;intérieur de la cavité du résonateur à générer un champ évanescent dans le voisinage de la périphérie du résonateur. Comme particules entrent dans le champ évanescent et se lient au résonateur, la longueur d&#39;onde de résonance des changements de résonateur en proportion du volume de la particule 8. En termes de capacité de détection, résonateurs microsphères ont précédemment été utilisé pour détecter la grippe A seule particules de virus (100 nm) 9,10. Récemment, résonateurs optiques microsphères plasmonically améliorée ont été utilisées pour détecter seul sérum albumine bovine molécules oligonucléotides 11 et 8-mères 12, mais cette approche limite la zone de capture des particules à 0,3 um 2 par device. Grandes biocapteurs de la zone de capture sont idéales pour maximiser les chances de détection de particules. Les technologies actuelles à base de solution sans étiquette biocapteurs avec de grandes (&gt; 100 um 2) zones de capture ont été limitées à la détection de particules de polystyrène ≥ 25 nm. Nous avons développé un système de biocapteur sans étiquette basée sur la technologie de résonateur optique connu sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) 13 (Figure 1) qui est capable de détecter en temps résolu de molécules simples en solution. FLEUR utilise la longue durée de vie des photons de résonateurs optiques microtoroid combinés à un verrouillage de fréquence commande de rétroaction, la détection équilibrée, et le filtrage de calcul pour détecter de petites particules jusqu&#39;à des molécules de protéines simples. L&#39;utilisation de la fréquence de verrouillage permet au système de toujours suivre la résonance de déplacement de la microtoroid que les particules se lient, sans la nécessité de balayer ou numériser la longueur d&#39;onde de laser surgrandes plages. Les principes de la fleur peuvent être utilisés pour améliorer les capacités de détection des autres techniques, y compris l&#39;amélioration plasmonique. Dans ce qui suit, les procédures pour effectuer FLEUR sont décrits.

<table><tbody><tr><td>Tunable diode laser</td><td>Newport</td><td>TLB-6300</td><td></td></tr><tr><td>Laser controller</td><td>Newport</td><td>TLB-6300-LN</td><td></td></tr><tr><td>Frequency locking feedback controller</td><td>Toptica Photonics</td><td>Digilock 110</td><td></td></tr><tr><td>Auto-balanced photoreceiver</td><td>Newport</td><td>Model 2007</td><td></td></tr><tr><td>In-line polarization controller</td><td>General Photonics</td><td>PLC-003-S-90</td><td></td></tr><tr><td>24-bit data acquisition card</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-4461</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human interleukin-2</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>R201520</td><td></td></tr><tr><td>20 nm polystyrene beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020A</td><td></td></tr><tr><td>NanoCube XYZ Piezo Stage</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-611.3</td><td></td></tr><tr><td>Optical table</td><td>Newport</td><td>VH3660W-OPT</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens for imaging column</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>Imaging column (adaptor tube)</td><td>Navitar Machine Vision</td><td>1-60228</td><td></td></tr><tr><td>High-Res CCD camera for imaging column</td><td>Edmund Industrial Optics</td><td>NT39244</td><td></td></tr></tbody></table>

label-free single molecule detection using microtoroid optical resonators

Détecter de faibles concentrations de molécules jusqu&#39;à la limite de la molécule unique a un impact sur des domaines tels que la détection précoce de la maladie, et des études fondamentales sur le comportement des molécules. Techniques simples de détection de molécule utilisent couramment des labels tels que des marqueurs fluorescents ou quantum dots, cependant, les étiquettes ne sont pas toujours disponibles, augmenter le coût et la complexité, et peuvent perturber les événements étudiés. Résonateurs optiques ont émergé comme un moyen prometteur pour détecter des molécules simples, sans l&#39;utilisation d&#39;étiquettes. Actuellement, la plus petite particule détectée par un système de résonateur non-renforcée plasmonically optique nue en solution est un polystyrène 25 nm une sphère. Nous avons développé une technique connue sous le verrouillage de fréquence optique Whispering évanescent résonateur (fleur) qui peut dépasser cette limite et d&#39;atteindre seule détection de molécule sans étiquette en solution aqueuse à 2. Comme échelles force du signal avec un volume de particules, notre travail représente un&gt; 100x improvement dans le rapport signal sur bruit (SNR) sur l&#39;état actuel de la technique. Voici les procédures à l&#39;origine FLEUR sont présentés dans le but d&#39;accroître son utilisation dans le domaine.

Événements de liaison des particules sont clairement vu que les changements de pas semblable à la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid au fil du temps (figure 2A). Les hauteurs de ces étapes sont présentés sous forme d&#39;histogramme à la figure 2B. Les figures 2-4 montrent des traces représentatives de la liaison des exosomes (de nanovésicules), des billes de silice de 5 nm, et simples humains interleukine-2 molécules, respectivement. Le fait que les événements de gradin échelle avec la taille des particules montre que la technique a été effectuée correctement. Ceci peut être analysé par la génération d&#39;un histogramme de hauteurs de palier (figure 2B) et la comparaison de la hauteur de marche maximale observée pour les prédictions théoriques, comme discuté ci-dessous. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma d&#39;un système de détection de tore. La lumière d&#39;une diode laser accordable est partagé w<html> un i-ième partie envoyé à travers la fibre optique qui couple la lumière dans le tore et l&#39;autre partie envoyé directement dans une entrée d&#39;un photo-récepteur d&#39;auto-équilibré. La sortie de la fibre optique est envoyé dans la deuxième entrée du photo-récepteur d&#39;auto-équilibré. La sortie du photorécepteur est envoyé à l&#39;unité de commande de rétroaction qui module la lumière laser pour localiser la valeur de la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid. Comme particules se fixent sur le tore, les décalages de fréquence de résonance. La différence entre la longueur d&#39;onde du laser et la longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid est envoyé à un contrôleur proportionnel intégral dérivé qui permet au laser pour correspondre à la longueur d&#39;onde du tore aussi rapidement et aussi bien que possible. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53180/53180fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a> <html> p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Résonance changement de longueur d&#39;onde au cours du temps comme des billes de 20 nm se lient à la surface de la microtoroid. (A) de décalage en longueur d&#39;onde de résonance de la microtoroid au cours du temps comme des billes de 20 nm se lie à la surface. (B) histogramme des hauteurs (amplitudes) de chaque événement résonance étape de longueur d&#39;onde. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53180/53180fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig3.jpg" /> Figure 3. Résonance changement de longueur d&#39;onde au cours du temps comme exosomes individuels se lient à la surface de la microtoroid. Événements de liaison individuels sont considérés comme des changements discrets (étapes) de la longueur d&#39;onde de résonance dans le temps.&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig4.jpg" /> Figure 4. Résonance changement de longueur d&#39;onde dans le temps sous forme de billes de silice de 5 nm se lier à la surface de la microtoroid. Les particules adhèrent à la surface du tore par adsorption passive. Événements de liaison de particules sont considérées comme des étapes distinctes dans la longueur d&#39;onde de résonance du tore dans le temps. Désorption d&#39;une particule est considérée comme une étape vers le bas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53180/53180fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53180/53180fig5.jpg" /> Figure 5. Résonance changement de longueur d&#39;onde dans le temps en tant que molécules d&#39;IL-2 se lie à la surface de la microtoroid. Événements de liaison macromoléculairessont considérés comme des étapes distinctes dans la longueur d&#39;onde de résonance au fil du temps. Ces étapes ressemblent à celles de la figure 4 que les deux types de particules sont de taille à peu près similaire. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53180/53180fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

label-free-single-molecule-detection-using-microtoroid-optical

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.2K vues.  California Institute of Technology. We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented. 

Vidéo: Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Fabrication of Silica Ultra High Quality Factor Microresonators

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the quality factor (Q) of the cavity, can be in excess of 500ns for cavities with Q factors above 100 million. As a result of their low material losses, silica microcavities have demonstrated some of the longest photon lifetimes to date1-2. Since a portion of the circulating light extends outside the resonator, these devices can also be used to probe the surroundings. This interaction has enabled numerous experiments in biology, such as single molecule biodetection and antibody-antigen kinetics, as well as discoveries in other fields, such as development of ultra-low-threshold microlasers, characterization of thin films, and cavity quantum electrodynamics studies.3-7
The two primary silica resonant cavity geometries are the microsphere and the microtoroid. Both devices rely on a carbon dioxide laser reflow step to achieve their ultra-high-Q factors (Q&gt;100 million).1-2,8-9 However, there are several notable differences between the two structures. Silica microspheres are free-standing, supported by a single optical fiber, whereas silica microtoroids can be fabricated on a silicon wafer in large arrays using a combination of lithography and etching steps. These differences influence which device is optimal for a given experiment.
Here, we present detailed fabrication protocols for both types of resonant cavities. While the fabrication of microsphere resonant cavities is fairly straightforward, the fabrication of microtoroid resonant cavities requires additional specialized equipment and facilities (cleanroom). Therefore, this additional requirement may also influence which device is selected for a given experiment.
Introduction
An optical resonator efficiently confines light at specific wavelengths, known as the resonant wavelengths of the device. 1-2 The common figure of merit for these optical resonators is the quality factor or Q. This term describes the photon lifetime (&tau;o) within the resonator, which is directly related to the resonator's optical losses. Therefore, an optical resonator with a high Q factor has low optical losses, long photon lifetimes, and very low photon decay rates (1/&tau;o). As a result of the long photon lifetimes, it is possible to build-up extremely large circulating optical field intensities in these devices. This very unique property has allowed these devices to be used as laser sources and integrated biosensors.10
A unique sub-class of resonators is the whispering gallery mode optical microcavity. In these devices, the light is confined in circular orbits at the periphery. Therefore, the field is not completely confined within the device, but evanesces into the environment. Whispering gallery mode optical cavities have demonstrated some of the highest quality factors of any optical resonant cavity to date.9,11 Therefore, these devices are used throughout science and engineering, including in fundamental physics studies and in telecommunications as well as in biodetection experiments. 3-7,12
Optical microcavities can be fabricated from a wide range of materials and in a wide variety of geometries. A few examples include silica and silicon microtoroids, silicon, silicon nitride, and silica microdisks, micropillars, and silica and polymer microrings.13-17 The range in quality factor (Q) varies as dramatically as the geometry. Although both geometry and high Q are important considerations in any field, in many applications, there is far greater leverage in boosting device performance through Q enhancement. Among the numerous options detailed previously, the silica microsphere and the silica microtoroid resonator have achieved some of the highest Q factors to date.1,9 Additionally, as a result of the extremely low optical loss of silica from the visible through the near-IR, both microspheres and microtoroids are able to maintain their Q factors over a wide range of testing wavelengths.18 Finally, because silica is inherently biocompatible, it is routinely used in biodetection experiments.
In addition to high material absorption, there are several other potential loss mechanisms, including surface roughness, radiation loss, and contamination loss.2 Through an optimization of the device size, it is possible to eliminate radiation losses, which arise from poor optical field confinement within the device. Similarly, by storing a device in an appropriately clean environment, contamination of the surface can be minimized. Therefore, in addition to material loss, surface scattering is the primary loss mechanism of concern.2,8
In silica devices, surface scattering is minimized by using a laser reflow technique, which melts the silica through surface tension induced reflow. While spherical optical resonators have been studied for many years, it is only with recent advances in fabrication technologies that researchers been able to fabricate high quality silica optical toroidal microresonators (Q&gt;100 million) on a silicon substrate, thus paving the way for integration with microfluidics.1
The present series of protocols details how to fabricate both silica microsphere and microtoroid resonant cavities. While silica microsphere resonant cavities are well-established, microtoroid resonant cavities were only recently invented.1 As many of the fundamental methods used to fabricate the microsphere are also used in the more complex microtoroid fabrication procedure, by including both in a single protocol it will enable researchers to more easily trouble-shoot their experiments.

We describe the use of a carbon dioxide laser reflow technique to fabricate silica resonant cavities, including free-standing microspheres and on-chip microtoroids. The reflow method removes surface imperfections, allowing long photon lifetimes within both devices. The resulting devices have ultra high quality factors, enabling applications ranging from telecommunications to biodetection.

Fabrication de silice Ultra High microrésonateurs facteur de qualité

Whispering gallery resonant cavities confine light in circular orbits at their periphery.1-2 The photon storage lifetime in the cavity, quantified by the ...

Recherche

Ingénierie

Optical Trapping of Nanoparticles

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping and manipulating small biological particles. Ashkin and co-workers first demonstrated optical tweezers using a single focused beam1. The single beam trap can be described accurately using the perturbative gradient force formulation in the case of small Rayleigh regime particles1. In the perturbative regime, the optical power required for trapping a particle scales as the inverse fourth power of the particle size. High optical powers can damage dielectric particles and cause heating. For instance, trapped latex spheres of 109 nm in diameter were destroyed by a 15 mW beam in 25 sec1, which has serious implications for biological matter2,3.
A self-induced back-action (SIBA) optical trapping was proposed to trap 50 nm polystyrene spheres in the non-perturbative regime4. In a non-perturbative regime, even a small particle with little permittivity contrast to the background can influence significantly the ambient electromagnetic field and induce a large optical force. As a particle enters an illuminated aperture, light transmission increases dramatically because of dielectric loading. If the particle attempts to leave the aperture, decreased transmission causes a change in momentum outwards from the hole and, by Newton's Third Law, results in a force on the particle inwards into the hole, trapping the particle. The light transmission can be monitored; hence, the trap can become a sensor. The SIBA trapping technique can be further improved by using a double-nanohole structure.
The double-nanohole structure has been shown to give a strong local field enhancement5,6. Between the two sharp tips of the double-nanohole, a small particle can cause a large change in optical transmission, thereby inducing a large optical force. As a result, smaller nanoparticles can be trapped, such as 12 nm silicate spheres7 and 3.4 nm hydrodynamic radius bovine serum albumin proteins8. In this work, the experimental configuration used for nanoparticle trapping is outlined. First, we detail the assembly of the trapping setup which is based on a Thorlabs Optical Tweezer Kit. Next, we explain the nanofabrication procedure of the double-nanohole in a metal film, the fabrication of the microfluidic chamber and the sample preparation. Finally, we detail the data acquisition procedure and provide typical results for trapping 20 nm polystyrene nanospheres.

The following setup approach details low power optical trapping of dielectric nanoparticles using a double-nanohole in metal film.

Le piégeage optique de nanoparticules

Optical trapping is a technique for immobilizing and manipulating small objects in a gentle way using light, and it has been widely applied in trapping ...

Synthesis and Operation of Fluorescent-core Microcavities for Refractometric Sensing

This paper discusses fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic analysis setup. These structures are based on the formation of a fluorescent quantum-dot (QD) coating on the channel surface of a conventional microcapillary. Silicon QDs are especially attractive for this application, owing in part to their negligible toxicity compared to the II-VI and II-VI compound QDs, which are legislatively controlled substances in many countries. While the ensemble emission spectrum is broad and featureless, an Si-QD film on the channel wall of a capillary features a set of sharp, narrow peaks in the fluorescence spectrum, corresponding to the electromagnetic resonances for light trapped within the film. The peak wavelength of these resonances is sensitive to the external medium, thus permitting the device to function as a refractometric sensor in which the QDs never come into physical contact with the analyte. The experimental methods associated with the fabrication of the fluorescent-core microcapillaries are discussed in detail, as well as the analysis methods. Finally, a comparison is made between these structures and the more widely investigated liquid-core optical ring resonators, in terms of microfluidic sensing capabilities.

Fluorescent-core microcavity sensors employ a high-index quantum-dot coating in the channel of silica microcapillaries. Changes in the refractive index of fluids pumped into the capillary channel cause shifts in the microcavity fluorescence spectrum that can be used to analyze the channel medium.

Synthèse et exploitation des Fluorescent-core Microcavités de détection réfractométrique

This paper discusses  fluorescent core microcavity-based sensors that can operate in a microfluidic  analysis setup. These structures are based on the ...

Implementation of a Reference Interferometer for Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing its free spectral range (FSR), the module is put in parallel with a fiber taper-microcavity system and then calibrated through isolating and eliminating random shifts in the laser frequency (i.e. laser jitter noise). To realize the taper-microcavity junction and to maximize the optical power that is transferred to the resonator, a single-mode optical fiber waveguide is pulled. Solutions containing polystyrene nanobeads are then prepared and flown to the microcavity in order to demonstrate the system&#8217;s ability to sense binding to the surface of the microcavity. Data is post-processed via adaptive curve fitting, which allows for high-resolution measurements of the quality factor as well as the plotting of time-dependent parameters, such as resonant wavelength and split frequency shifts. By carefully inspecting steps in the time-domain response and shifting in the frequency-domain response, this instrument can quantify discrete binding events.

A reference interferometer technique, which is designed to remove undesirable laser jitter noise for nanodetection, is utilized for probing an ultra-high quality factor microcavity. Instructions for assembly, setup, and data acquisition are provided, alongside the measurement process for specifying the cavity quality factor.

La mise en œuvre d&#39;un interféromètre de référence pour Nanodetection

A thermally and mechanically stabilized fiber interferometer suited for examining ultra-high quality factor microcavities is fashioned. After assessing ...

Fabrication and Testing of Microfluidic Optomechanical Oscillators

Cavity optomechanics experiments that parametrically couple the phonon modes and photon modes have been investigated in various optical systems including microresonators. However, because of the increased acoustic radiative losses during direct liquid immersion of optomechanical devices, almost all published optomechanical experiments have been performed in solid phase. This paper discusses a recently introduced hollow microfluidic optomechanical resonator. Detailed methodology is provided to fabricate these ultra-high-Q microfluidic resonators, perform optomechanical testing, and measure radiation pressure-driven breathing mode and SBS-driven whispering gallery mode parametric vibrations. By confining liquids inside the capillary resonator, high mechanical- and optical- quality factors are simultaneously maintained.

Parametric optomechanical excitations have recently been experimentally demonstrated in microfluidic optomechanical resonators by means of optical radiation pressure and stimulated Brillouin scattering. This paper describes the fabrication of these microfluidic resonators along with methodologies for generating and verifying optomechanical oscillations.

Fabrication et les essais de microfluidiques opto oscillateurs

Cavity optomechanics experiments that parametrically couple the phonon modes and photon modes have been investigated in various optical systems including ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

Fixation des sondes biologiques à des biocapteurs optiques de silice à l&#39;aide d&#39;agents de couplage au silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Bio-ingénierie

Fabrication and Operation of a Nano-Optical Conveyor Belt

The technique of using focused laser beams to trap and exert forces on small particles has enabled many pivotal discoveries in the nanoscale biological and physical sciences over the past few decades. The progress made in this field invites further study of even smaller systems and at a larger scale, with tools that could be distributed more easily and made more widely available. Unfortunately, the fundamental laws of diffraction limit the minimum size of the focal spot of a laser beam, which makes particles smaller than a half-wavelength in diameter hard to trap and generally prevents an operator from discriminating between particles which are closer together than one half-wavelength. This precludes the optical manipulation of many closely-spaced nanoparticles and&#160;limits the&#160;resolution of optical-mechanical systems. Furthermore, manipulation using focused beams requires beam-forming or steering optics, which can be very bulky and expensive. To address these limitations in the system scalability of conventional optical trapping our lab has devised an alternative technique which utilizes near-field optics to move particles across a chip. Instead of focusing laser beams in the far-field, the optical near field of plasmonic resonators produces the necessary local optical intensity enhancement to overcome the restrictions of diffraction and manipulate particles at higher resolution. Closely-spaced resonators produce strong optical traps which can be addressed to mediate the hand-off of particles from one to the next in a conveyor-belt-like fashion. Here, we describe how to design and produce a conveyor belt using a gold surface patterned with plasmonic C-shaped resonators and how to operate it with polarized laser light to achieve super-resolution nanoparticle manipulation and transport. The nano-optical conveyor belt chip can be produced using lithography techniques and easily packaged and distributed.

The scalability and resolution of conventional optical manipulation techniques are limited by diffraction. We circumvent the diffraction limit and describe a method of optically transporting nanoparticles across a chip using a gold surface patterned with a path of closely spaced C-shaped plasmonic resonators.

Fabrication et fonctionnement d&#39;un Convoyeur Nano-optique

The technique of using focused laser beams to trap and exert forces on small particles has enabled many pivotal discoveries in the nanoscale biological ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolor détection Fluorescence pour Droplet microfluidique utilisant des fibres optiques

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

Biochimie

Optical Biosensing

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable signal such as fluorescence,&#160;or these sensors can be label-free&#160;and use the changes in optical properties, such as refractive index, to sense for the binding of the target molecule. This video introduces both label and label-free optical biosensors, demonstrates their use in the laboratory, and shows some applications of the technology.

Types of Optical Biosensing; Surface Plasmon Resonance SPR

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable signal such as fluorescence, or these sensors can be label-free&#160;and use the changes in optical properties, such as refractive index, to sense for the binding of the target molecule. This video introduces both label and label-free optical biosensors, demonstrates their use in the laboratory, and shows some applications of the technology.

Biodétection optique

Optical biosensors utilize light to detect the binding of a target molecule. These sensors can utilize a label molecule, which produces a measurable ...

Simple détection de molécule libre Label-Utilisation Microtoroid optiques résonateurs

Résumé

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