Name: Vidéo: Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney
Uploaded: 2015-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 11.8K vues. Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Nous apprécions Sarissa biomédicale pour leur travail dans le développement des capteurs utilisés dans le présent manuscrit. Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute accorde HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) et HL 122662 (A. Staruschenko et A. Cowley), un projet financé par le Medical College of Comité des affaires recherche Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) et de faire progresser un programme de recherche et d&#39;enseignement sain Wisconsin # 9520217, et le Young Investigator Grant de la National Kidney Foundation (O. Palygin).

Les procédures sur les animaux suivants ont adhéré à la NIH Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. L&#39;approbation préalable a été obtenue à partir du Comité des soins et de l&#39;utilisation des animaux institutionnel (IACUC). REMARQUE: Examen des instructions du fabricant du capteur doit être fait lors de la conception de l&#39;expérience et avant leur utilisation. Suite à ces instructions produire des résultats optimaux lorsque vous utilisez les capteurs. 1. Calibrage du capteur <ol><li> Préparer des solutions de base fraîches avant le début de l&#39;expérience. </li><li> Insérer le tampon A contenant 10 mM de tampon NaPi, 100 mM de NaCl, 1 mM de MgCl2, et 2 mM de glycerol. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH. Stocker à 2-8 ° C. </li><li> En utilisant une concentration stock ATP (100 mM) stocké à -20 ° C, de créer une nouvelle solution ATP 10 mM d&#39;étalonnage en ajoutant 10 pi de stock à 90 pi de tampon A. </li><li> Réhydrater le capteur ATP en plaçant sa pointe (Figure 2) dans til chambre de réhydratation contenant tampon A pendant au moins 10 min à 2-8 ° C. NOTE: Après réhydratation, les capteurs ne doit pas être exposé à l&#39;air pendant plus de 20 secondes ou de la sensibilité du capteur peut être réduite. Si les longues expositions à l&#39;air sont prévus, plonger le capteur brièvement dans une solution de glycérol. Les capteurs peuvent être utilisés pour des expériences multiples, mais ceux-ci doivent se produire sur le même jour que la réhydratation capteur. Les capteurs peuvent être stockés dans la chambre de réhydratation avec du tampon A jusqu&#39;à 24 heures. </li><li> Tournez sur le canal potentiostat double (Figure 3) et démarrer le logiciel de système d&#39;enregistrement. </li><li> Préparer une chambre d&#39;étalonnage avec 3 ml de tampon A. La place de l&#39;électrode de référence dans la chambre de calibrage. Prenez chaque capteur de la chambre de réhydratation, puis attachez-le au manipulateur et l&#39;insérer dans la solution de la chambre d&#39;étalonnage. REMARQUE: Utilisez une boîte de Pétri enduit de silicone standard en tant que chambre de calibrage. Effectuer tous les étalonnages et studies dans une cage de Faraday sur un laboratoire de table d&#39;air haute performance pour réduire le bruit du signal pendant les enregistrements ampérométrie (figure 4). Étalonnages sont mieux fait au plus près du début de la collecte de données que possible. Pour des applications in vivo le moment optimal pour le calibrage est au cours de la période de récupération post-chirurgie des animaux. </li><li> Ex vivo étalonnage <ol><li> Effectuer voltamétrie cyclique dans la chambre de calibrage par le vélo les capteurs de -500 mV à 500 mV à un taux de 100 mV / s pour 10 cycles. Cela améliore considérablement la sensibilité des capteurs. Voir Figure 5 pour les traces observées à partir des 10 cycles. </li><li> Polariser les capteurs à 600 mV après le dernier cycle. Le courant de la sonde se désintègre à une asymptote. Une lecture d&#39;équilibre est atteint après un minimum de 5 min. Enregistrez la lecture zéro. </li></ol></li><li> Dans étalonnage de capteur in vivo <ol><li> Ne pas effectuer la voltamétrie cyclique sur le in vivo sensors. Au lieu de cela, polariser le capteur dans la chambre de calibrage pendant 30 s à 500 mV. Réglez ensuite le potentiostat à 0 mV et laisser le courant du capteur remonter à une asymptote. Le courant du capteur prendra au moins 2 min à asymptote. Enregistrez la lecture zéro. </li></ol></li><li> Consécutivement ajouter des quantités fixes de solution ATP dans la chambre pour produire une ligne de calibrage englobant une gamme de détection souhaitée. La solution ATP produit un pic aigu dans le signal du capteur d&#39;abord, suivie d&#39;une décroissance de l&#39;ATP diffuse uniformément dans la chambre. Valeurs de signal d&#39;enregistrement une fois que le niveau de signal est stabilisé après chaque addition ATP. Figures 6A et 7 montrent des traces et a suggéré concentrations d&#39;ATP à la fois ex vivo et des études in vivo, respectivement. NOTE: Il est important de confirmer la sélectivité des électrodes en utilisant des charognards des analytes. La présente protocole utilisé apyrase pour tester la spécificité de la détection de l&#39;ATP et de la catalase pour la H &lt;sub&gt; 2 O 2 signal (figures 6B). Si les médicaments doivent être administrés, les mesures de réactivité avec les leurs capteurs doivent être déterminés avant l&#39;étude. </li><li> Ajouter 3 pi de apyrase partir d&#39;un stock de 2 mg / ml (89 ONU / mg) pour tester la spécificité du capteur de l&#39;ATP (le courant produit par l&#39;application de l&#39;ATP devrait réduire au niveau zéro (figure 7). </li><li> Ajouter 3 pi de la catalase à partir d&#39;un stock de 2 mg / ml (100 UN / mg) pour tester la spécificité du capteur null (le courant produit par H 2 O 2 demande devrait réduire à la lecture de zéro). </li></ol> 2. chirurgie des animaux pour les études de capteurs <ol><li> Chirurgie ex vivo <ol><li> Anesthésier l&#39;animal expérimental avec l&#39;isoflurane (5% induction, de 1,5 à 2,5% maintenance) / grade médical O 2 ou d&#39;une autre méthode approuvée. 15 &#39;12 animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d&#39;anesthésie. Strespiratoires vitesse de réaction et de pincement de l&#39;orteil mesure sont utilisés pour confirmer l&#39;anesthésie appropriée. Remarque: Euthanasier l&#39;animal selon des protocoles approuvés IACUC. À la fin de toutes les procédures non-survie euthanasier les animaux profondément anesthésiés par thoracotomie induire pneumothorax pour assurer la disparition de l&#39;animal humain 12. </li><li> Placez le rat sur une table d&#39;opération à température contrôlée dans une position couchée. Tout en maintenant une profondeur de l&#39;anesthésie adéquate, faire une incision médiane d&#39;environ 5 cm en ligne avec le rein gauche et d&#39;exposer l&#39;aorte abdominale distale. </li><li> Enveloppez une ligature autour de la maladie coeliaque et les artères mésentériques supérieure et l&#39;aorte abdominale au-dessus de ces artères, mais ne pas ligaturer. Envelopper deux ligatures autour de l&#39;aorte abdominale en dessous des artères rénales. </li><li> Fixer l&#39;aorte abdominale au-dessus des ligatures. Attachez la ligature inférieure. Sonder l&#39;aorte abdominale avec des tubes en polyéthylène (PE50). Fixez le cathéter avec la deuxième ligature de l&#39;aorte. </li><li> Retirer la pince et ligaturer les artères mésentériques et la maladie cœliaque. Perfuser le rein à 6 ml / min avec une solution de sel équilibrée de Hanks à température ambiante pendant 2-3 min jusqu&#39;à ce que le rein est complètement blanchi. </li><li> Exciser le rein et le cathéter, la partie de l&#39;aorte connecté. Placez le rein dans une boîte de Petri 3 ml rempli de solution de bain. Remarque: protocole d&#39;essai peut être effectué à température ambiante. La solution de bain contient en mM: NaCl 145, KCl 4,5, MgCl2 2, CaCl2 1, 10 HEPES, pH ajusté avec du NaOH à 7,35. </li></ol></li><li> Chirurgie pour in vivo <ol><li> Anesthésier le rat en utilisant des protocoles approuvés IACUC. Pour l&#39;analyse in vivo anesthésier les rats avec de la kétamine (20 mg / kg IM) et Inactin (50 mg / kg ip). Les animaux doivent être surveillés en permanence pour assurer un niveau adéquat d&#39;anesthésie. A la vitesse de réaction respiratoire et pincement de l&#39;orteil stables sont utilisés pour confirmer l&#39;anesthésie appropriée. </li><li> Après la profondeur de l&#39;anesthésie appropriée est d&#39;obtenired, placer le rat en décubitus dorsal sur une surface à température contrôlée est échoué situé sur la table pneumatique. La surface doit être préchauffé et maintenu à 36 ° C. </li><li> Tout en maintenant la profondeur de l&#39;anesthésie adéquate, faire une incision médiane d&#39;environ 5 cm en ligne avec le rein. </li><li> Utiliser un fil de suture pour dévier et ancrer le tissu cutané et sous-cutané de façon que l&#39;ensemble du rein est visible. Placez le rein dans une tasse de rein de minimiser les artéfacts de mouvement. </li><li> Utilisation d&#39;une perfusion intraveineuse de 2% de BSA: 0,9% de NaCl à 1 ml / 100 g / h par la veine jugulaire pour maintenir le volume du sang. Cathétériser deux uretères pour la collecte d&#39;urine. La place des liens autour des artères mésentériques et coeliaques supérieures et l&#39;aorte distale pour la manipulation de la pression de perfusion rénale (figures 10A). </li><li> Si l&#39;application d&#39;agents pharmacologiques est nécessaire pendant les expériences in vivo, l&#39;insertion d&#39;un cathéter interstitiel est recommandé (figures 10B </strong&gt;). </li></ol></li></ol> Configuration 3. Acquisition de données <ol><li> Ouvrez le programme d&#39;acquisition de données et de définir sa polarité à la fois ex vivo et in vivo à des expériences anodique positive. Réglez le programme pour enregistrer les données sous forme de code ASCII. </li><li> Placez les micromanipulateurs pour l&#39;insertion rapide des capteurs dans les reins. NOTE: Vous pouvez également utiliser une sonde fictive attaché à la micromanipulateur pour aider à atteindre le positionnement souhaité de capteurs. </li><li> Ex acquisition de données in vivo <ol><li> Perfuser le rein avec une solution de bain (de 2.1.6) par l&#39;intermédiaire d&#39;une canule de l&#39;aorte à une vitesse constante de 650 ul / min. Avec des ciseaux chirurgicaux, retirez soigneusement la capsule rénale, qui est nécessaire pour l&#39;insertion de la sonde. </li><li> Fixez le rein avec des bandes de caoutchouc attachés sur le rein et attachés au plat enduit de silicone avec des épingles. </li><li> Placez l&#39;électrode de référence près de rein dans la boîte de Pétri avec sa pointe immergée dansla solution tampon. </li></ol></li><li> Dans l&#39;acquisition de données in vivo <ol><li> Placez le rein dans une tasse de rein. Selon la souche et l&#39;âge de l&#39;animal utiliser une taille de tasse qui détient le rein lâche. La figure 8 montre deux tailles de tasses rénaux. Tasses similaires sont utilisés pour différentes approches physiologiques ont porté sur l&#39;analyse de la fonction rénale, tels que microponction etc 16. Remarque: La position de la coupe du rein est essentiel pour éliminer le bruit mécanique produite par la respiration des animaux, mais ne devrait pas interférer avec ou bloquer la perfusion rénale ou l&#39;écoulement d&#39;urine. </li><li> Comptez 45 min de temps de récupération avant d&#39;effectuer la collecte de données. </li><li> En utilisant une aiguille 26-30G, faire un trou de perforation à l&#39;endroit désiré et la profondeur de la sonde dans le rein. Éponger le trou de surface pour enlever le sang exsudation. Ajouter une solution de glycerol à la surface du rein. Cela permettra d&#39;éviter la surface de rein de sécher pendant l&#39;expérience. </li&gt; <li> Retirer le premier capteur de la chambre de réhydratation et l&#39;attacher à la micromanipulateur. Rapidement, dans les 20 secondes, insérer l&#39;électrode dans le trou fraîchement créé dans le rein. Répétez les étapes 3.5 à 3.9 pour le capteur nulle. </li><li> Insérez l&#39;électrode de référence dans le rein, d&#39;environ 1 cm à partir des capteurs. </li></ol></li><li> Tournez sur le potentiostat et activer le programme d&#39;enregistrement de l&#39;ordinateur. La figure 9 montre la configuration finale de l&#39;acquisition de données de rein ex vivo. La figure 10 montre la configuration finale de l&#39;acquisition des données in vivo du rein avec un cathéter inséré. </li></ol> Analyse des données 4. <ol><li> Importer le fichier de données ASCII dans origine ou de tout autre logiciel similaire. </li><li> Concentration relation actuelle <ol><li> Utilisez la fonction ajustement linéaire / extrapoler pour construire une concentration linéaire (axe des x) en courant (axe des y) relation pour l&#39;ATP ou H 2 </sub&gt; points O 2 d&#39;étalonnage (Figures 6 et 7). linéaire ligne d&#39;ajustement: y = mx + b </li></ol></li><li> Equate le courant de la concentration </li><li> Soustraire les traces de mesure du capteur de zéro à partir de ceux de la sonde de l&#39;ATP pour obtenir le courant réel produite par l&#39;ATP intracellulaire. </li><li> Convertir les valeurs de l&#39;ATP en Pa obtenus par ampérométrie à nm en utilisant l&#39;équation de calibrage décrite en 4.2.1. Déterminer la concentration de la trace de données soustrait du capteur ATP en important chaque courant ajusté dans la valeur &quot;x&quot; et de résolution pour y (la concentration de substance à analyser). </li><li> De même, le calcul de la concentration de H 2 O 2 à partir de son équation d&#39;étalonnage, si nécessaire. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+consequences+of+using+micro-electrodes+and+microdialysis+probes+in+the+brain.">Invasive consequences of using micro-electrodes and microdialysis probes in the brain.</a> Trends Anal. Chem. 22, 503-508 (2003).</li></ol>

Capteurs pour l&#39;enregistrement vidéo de ce manuscrit ont été fournis par Sarissa Biomedical Limited (Coventry, Royaume-Uni).

Les présents protocoles ont été développés pour fournir une meilleure résolution temporelle et spatiale de l&#39;ATP et de H 2 O 2 pour la signalisation des reins perfusés par le sang isolés ex vivo, et in vivo perfusé. Les différences entre les protocoles et les capteurs utilisés ici fournissent acquisition de données optimale pour soit des agents pharmacologiques ou des études physiologiques. Les protocoles sont constitués d&#39;une) capteur étalonnage, 2) intervention chirurgicale, 3) l&#39;installation d&#39;acquisition de données, et 4) l&#39;analyse des données. Ils permettent des mesures en temps réel de nombreux analytes pour des conditions expérimentales. Cela conduira à un meilleur aperçu des maladies du rein et le développement de traitements pharmacologiques plus efficaces. Ici, nous avons utilisé les capteurs pour analyser l&#39;ATP et de H 2 O 2. Cependant, des capteurs pour d&#39;autres substances sont également disponibles et peuvent être utilisés. Les protocoles décrits ici ont été appliqués à étudier ATP et H 2 O 2 dans les reins de rats, mais le même méthod peut facilement être ajusté pour une application chez la souris. Ainsi, cette approche a un grand potentiel compte tenu de l&#39;abondance de modèles de rongeurs génétiques. La conception de base de biocapteurs de microélectrodes enzymatiques a été développé dans les années 1960 par Clark et Lyons 2. Après le développement initial de biocapteurs, des progrès ont été réalisés dans la conception et les applications 20 17-19. Llaudet et al. 21,22 développé la conception de principe des capteurs ATP utilisés dans les présentes méthodes en utilisant des protocoles de Cosneir et al. 23 pour le revêtement de l&#39;enzyme. Ces capteurs ont détecté la signalisation ATP dans un certain nombre de processus physiologiques, y compris la libération d&#39;ATP des astrocytes du cerveau 8, la régulation de la respiration 4,24, et le muscle squelettique règlement artériole 25. Récemment, le protocole ex vivo a été utilisé pour mesurer la signalisation ATP dans les reins 12. Le but de ce manuscrit is de fournir des orientations et des idées efficaces pour la détection de substances endogènes tels que l&#39;ATP dans les reins. Biocapteurs enzymatiques de microélectrodes présentent de nombreux avantages sur les moyens existants pour mesurer des analytes in vivo. Cependant, des précautions particulières doivent être utilisés à cette approche que pour toute autre méthode nouvelle. Validation avec une approche établie donne confiance dans les données obtenues. Par exemple, les mesures de microdialyse ont été faites comme décrit précédemment 26,27. Aucune différence significative n&#39;a été observée entre les concentrations maximales déterminées par les capteurs et celles obtenues à partir des échantillons de dialyse 12. La limitation de microdialyse est qu&#39;il ne mesure les niveaux d&#39;analyte à l&#39;état stable. En tant que tel, l&#39;évaluation des changements dynamiques dans la signalisation cellulaire ne peut être obtenue avec l&#39;utilisation des biocapteurs enzymatiques de micro-électrodes. Les spécifications manufacture de temps de réponse du capteur diffèrent entre le capteurex vivo. types de capteurs ont un temps de 5 à 10 secondes et à des capteurs in vivo de 30 à 35 secondes pour la montée du signal de 10 à 90% de réponse. Les traces d&#39;étalonnage (figures 6 et 7) montrent la résolution dans le temps de l&#39;addition de l&#39;analyte / l&#39;enlèvement. Pour les capteurs et les deux approches microdialyse, l&#39;utilisation d&#39;enzymes spécifiques pour bloquer le signal produit par analytes est nécessaire pour assurer la spécificité. Les protocoles décrits ont plusieurs défis. Comme avec toute insertion de la sonde dans le tissu, des dommages aux tissus ne se produit. Cela pourrait activer les voies de signalisation qui peuvent influencer les mesures 28. Pour minimiser les dommages de la cellule, des capteurs plus minces seraient nécessaires. Cependant, il est difficile de pénétrer dans la capsule du rein avec les capteurs de sorte aiguilles sont utilisées pour faire un petit trou d&#39;entrée. Capteurs minces sont plus susceptibles de se plier et de perturber leur revêtement sur l&#39;insertion. Capteurs de plus grand diamètre sont flexion plus résistant et le resultadommages nt à leur revêtement. La figure 3 montre un capteur mince et épaisse. En plus de la résistance du capteur d&#39;épaisseur à la flexion, ils comprennent une couche plus épaisse de revêtement, en fournissant une protection accrue de la couche enzymatique. La préoccupation des dommages aux tissus causés par l&#39;utilisation de capteurs d&#39;épaisseur était beaucoup moins dans les reins à ce qu&#39;elle serait dans le tissu cérébral. La profondeur d&#39;insertion est approchée et le placement final devrait être vérifiée après des mesures sur le rein sont terminées. Estimation entre les couches du cortex et de la moelle en utilisant le capteur de longueur de la pointe comme un guide d&#39;insertion et est suffisant que la pointe du capteur est de 0,5 mm et le cortex du rein est de 2-3 mm d&#39;épaisseur. L&#39;encrassement de la sonde se produit également à une vitesse supérieure dans le sang, ce qui limite l&#39;utilisation du capteur en temps dans des protocoles in vivo pour une expérience. Les durées d&#39;enregistrement de 1 à 1 ½ h abouti qu&#39;à une petite dérive de la sonde. Les principaux critères pour évaluer la performance du capteur est réduite la faible sensibilitéà l&#39;analyte au cours du processus d&#39;étalonnage. Bruit électrique accrue et l&#39;instabilité du courant de base peuvent aussi indiquer que la pointe du capteur est endommagé. Pour des mesures précises de l&#39;ATP, les deux capteurs (ATP et NULL) doivent avoir des caractéristiques de bruit et de stabilité similaires en vue de la soustraction du signal. Dans le cas contraire, l&#39;un des capteurs doivent être remplacés. Pour un faible bruit et la détection de faibles concentrations d&#39;analyte, l&#39;utilisation de nouveaux capteurs pour chaque animal est suggérée. Plusieurs étapes sont cruciales pour les résultats expérimentaux réussis. Les capteurs sont très fragiles et doivent être manipulés avec précaution pour éviter d&#39;endommager la pointe du capteur. En outre, après réhydratation, les capteurs ne doivent pas être exposées à l&#39;air pendant plus de 20 s. Des enregistrements à faible bruit sont nécessaires pour la détection réussie de signaux biologiques dans les tissus. A cet effet, une table d&#39;air de laboratoire de haute performance et de terre correcte est exigée. L&#39;addition de quantités exactes de l&#39;analyte durcompris les étapes d&#39;étalonnage est nécessaire pour déterminer la concentration exacte dans les expériences. Parvenir à une bonne compensation du rein en ex vivo chirurgies rénaux se traduira par de bons enregistrements. L&#39;utilisation d&#39;enzymes apyrase et de la catalase dans les étalonnages et dans des expériences permet d&#39;évaluer la sensibilité de capteur non spécifique et confirme les mesures. Ces protocoles prévoient grandement améliorées détail de signalisation extracellulaire dans les reins. L&#39;amélioration de la sensibilité et une résolution temporelle offerte par les capteurs peuvent nous permettre de résoudre des changements dans l&#39;ATP de signalisation dans les états pathologiques et suivants manipulation pharmacologique qui étaient auparavant indétectable. Le protocole in vivo est bien adapté pour les études physiologiques complexes tout en ex vivo est optimal pour l&#39;étude des applications pharmacologiques sur les reins. La conception du capteur in vivo utilisé ici permet une résistance sans précédent contre l&#39;ingérence dans blood tissu perfusé. Pris ensemble, ces capteurs offrent une grande quantité d&#39;applications qui étaient auparavant pas possible avec les protocoles et techniques existantes.

Biocapteurs de microélectrodes enzymatique (également mentionnés comme des capteurs dans le présent manuscrit) ont été un outil précieux pour l&#39;étude des processus de signalisation dynamiques dans les cellules et les tissus vivants. Les capteurs permettent d&#39;augmenter la résolution temporelle et spatiale des molécules de signalisation cellulaire dans des concentrations biologiquement pertinentes. Au lieu de l&#39;échantillonnage et l&#39;analyse de fluides extracellulaires prélevés à des intervalles de plus longues périodes de temps, ces capteurs réagissent aussi vite que leurs enzymes réagissent à l&#39;analyte, produisant ainsi des mesures en temps réel de 1,2. Détection rapide des concentrations interstitielles de facteurs autocrine et paracrine, comme purines ou le peroxyde d&#39;hydrogène, et la dynamique de leur libération peut être utilisé pour établir un profil pour les effets des médicaments dans des conditions normales et pathologiques 3. Actuellement, la plupart des applications utilisant des capteurs ont été dans des coupes de tissu de cerveau et de cultures de cellules 4-10. Les protocoles détaillés dans ce but manuscritétablir les moyens de mesurer avec précision les concentrations en temps réel des analytes dans les reins entiers. Les protocoles suivants ont été développés pour étudier l&#39;ATP interstitiel et H 2 O 2 dans les reins signalisation. Dans l&#39;environnement natif du rein, l&#39;ATP extracellulaire est rapidement catabolisée par ectonucléotidases endogènes dans ses dérivés (ADP, AMP et de l&#39;adénosine). Les capteurs utilisés ici sont très sélectifs à l&#39;ATP par rapport aux autres purines ou des produits de dégradation de l&#39;ATP 11. Cela offre un grand avantage, car elle permet un suivi précis des concentrations constantes et dynamiques de la libération d&#39;ATP et sa fonction de signalisation. Concentration interstitielle ATP est mesurée en utilisant la combinaison de deux microélectrodes, un capteur et un capteur ATP Null. Le capteur Null en combinaison avec des applications de la catalase est capable de détecter H 2 O 2 interstitiel 12 concentrations. Les protocoles suivants utilisent deux modèles différents de sensors qui ont des caractéristiques optimales pour soit ex vivo ou in vivo. applications Les deux modèles sont basés sur la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate oxydase contenue dans une couche de capteur enzymatique et est entraîné par la présence d&#39;ATP. Dans l&#39;ensemble des capteurs utilisés dans les études ex vivo, H 2 O 2, le produit enzymatique finale de la réaction, est détectée par oxydation sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Capteurs pour des études in vivo sont basés sur la place H 2 O 2 de réduction sur une électrode d&#39;or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Illustrée à la figure 1 est un schéma de deux protocoles décrits dans ce manuscrit. Le capteur Null est identique à son capteur de l&#39;ATP correspondante, sauf qu&#39;il n&#39;a pas les enzymes liées. Par conséquent, en plus de la détection de H 2 O 2 avec la catalase enzyme, le capteur de mea NullSures interférences non spécifiques. Concentrations d&#39;ATP sont calculées en soustrayant la détection des interférences non spécifiques Null fond et H 2 O 2 à partir du signal de détection de l&#39;ATP. Plusieurs capteurs sont également disponibles dans le commerce pour détecter d&#39;autres analytes, y compris l&#39;adénosine, ionosine, hypoxanthine, l&#39;acétylcholine, choline, le glutamate, le glucose, le lactate, la D-sérine des applications Ex vivo ou adénosine, ionosine et hypoxanthine pour in vivo quand il est associé avec le Null correspondant capteur. La capacité du capteur pour détecter les analytes avec précision dépend de la pré- approprié et étalonnages post-13. Cela garantit que représente l&#39;analyse de la dérive de la sensibilité du capteur qui se produit lors de l&#39;utilisation dans les tissus biologiques. Le capteur est titulaire d&#39;un dépôt de glycerol qui est utilisée comme réactif dans les réactions enzymatiques capteurs. Si le capteur est pas utilisé dans les solutions de bain contenant du glycerol, il laver dans le temps. Shorter rent reprises sont alors nécessaires pour minimiser la dérive de la sonde. En outre capteur d&#39;encrassement par des proteases endogènes et les fragments de protéines peut grandement diminuer la sensibilité des capteurs 14. La présente manuscrit établit l&#39;utilisation de biocapteurs de microélectrodes enzymatiques pour ex vivo et in vivo des préparations de rein. En temps réel analyte quantification fournit des détails sans précédent de la signalisation cellulaire qui peut révéler de nouvelles perspectives sur les mécanismes de maladies du rein et des agents pharmacologiques.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sensor Kit</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBK-ATP-05-125</td>
			<td>The kit includes storage bottle, rehydration chamber, electrode leads, and reference electrodes.&#160; Also included with the kit is the user&#39;s choice of sensors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Biosensor 125 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-ATP-05-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold ATP Biosensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-ATP-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe null sensor 125&#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SBS-NUL-20-125</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissagold null sensor 50 &#956;m</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td>SGS-NUL-10-50</td>
			<td>store at 2-8 C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarissaprobe ATP Manual</td>
			<td>Sarissa Biomedical</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf">http://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage&#160;</td>
			<td>TMC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual channel potentiostat</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2021</td>
			<td>Type II Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition program</td>
			<td>Digi-Ivy</td>
			<td>DY2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Razel Scientific Instruments</td>
			<td>Model R99E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber optic illuminator</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>air table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane ventilator</td>
			<td>LEI Medical</td>
			<td>M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S3358OA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td></td>
			<td>26-30 gauge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Standard dissection pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Polyethylene tubing (PE50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter tissue glue</td>
			<td>Vetbond</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture</td>
			<td>Look</td>
			<td>SP117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber bands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>any 2-4 mm wide rubber bands</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone</td>
			<td>Momentive</td>
			<td>RTV-615 Clear 1#</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clamp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18052-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard dissection kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kit should include scalpel and dissection sissors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kidney Cup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Of own design</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>standard chemicals</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6559-25UMO</td>
			<td>100 mM ATP solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>216763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine</td>
			<td>Clipper</td>
			<td>2010012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of enzymatic biosensors to quantify endogenous atp or h2o2 in the kidney

Biocapteurs de microélectrodes enzymatiques ont été largement utilisés pour mesurer la signalisation extracellulaire en temps réel. La plupart de leur utilisation a été limitée à des tranches de cerveau et cultures de cellules neuronales. Récemment, cette technologie a été appliquée à l&#39;ensemble des organes. Les progrès dans la conception de capteurs ont rendu possible la mesure de la signalisation cellulaire dans le sang perfusé dans les reins vivo. Les présents protocoles énumèrent les étapes nécessaires pour mesurer l&#39;ATP et H 2 O 2 signalisation dans le tissu interstitiel du rein de rat. Deux conceptions de capteurs séparés sont utilisés pour l&#39;ex vivo et in vivo dans des protocoles de. Les deux types de capteurs sont revêtus d&#39;une couche biologique enzymatique mince sur le dessus d&#39;une couche de permsélectivité pour donner réponse rapide, les biocapteurs sensibles et sélectives. La couche de perméabilité sélective protégeant le signal des substances interférentes dans le tissu biologique, et la couche enzymatique utilise la réaction catalytique séquentiel de la glycérol kinase et glycérol-3-phosphate-oxydase en présence d&#39;ATP pour produire H 2 O 2. L&#39;ensemble de capteurs utilisés pour les études ex vivo en outre analyte détecté par oxydation de l&#39;H 2 O 2 sur une platine / iridium (Pt-Ir) fil-électrode. Les capteurs pour les études in vivo sont plutôt basée sur la réduction de H 2 O 2 sur une électrode d&#39;or revêtu de médiateur conçu pour tissu perfusé de sang. Les changements de concentration finale est détecté par ampérométrie en temps réel suivie d&#39;étalonnage de concentrations connues d&#39;analyte. En outre, la spécificité du signal ampérométrique peut être confirmée par l&#39;addition d&#39;enzymes telles que la catalase et apyrase qui décomposent H 2 O 2 et de l&#39;ATP de façon correspondante. Ces capteurs comptent aussi beaucoup sur les étalonnages précis avant et après chaque expérience. Les deux protocoles suivants établissent l&#39;étude de la détection en temps réel de l&#39;ATP et H 2O 2 dans des tissus de rein, et peut être en outre modifié de manière à étendre la méthode décrite pour une utilisation dans d&#39;autres préparations biologiques ou d&#39;organes entiers.

La conception de la microélectrode biocapteur enzymatique permet la détection en temps réel des analytes dans les reins entiers. La conception de l&#39;expérience générale pour les ex vivo ou in vivo est illustrée à la figure 1 capteurs .Les utilisés et les procédures chirurgicales diffèrent selon que l&#39;étude est ex vivo ou in vivo. Pour obtenir des résultats reproductibles, précise pré et post étalonnages sont essentielles. La figure 6A montre une trace représentatif du signal vu par le capteur ex vivo de l&#39;ATP au cours des étalonnages. Notez que apyrase rapidement éliminé du signal ATP. La catalase n&#39;a eu aucun effet sur ​​le signal ATP et démontre la spécificité de l&#39;H 2 O 2 il crée (figure 6B). La procédure d&#39;étalonnage produit un ajustement linéaire qui est utilisé pour calculer les changements dynamiques de l&#39;ATP (figure 6A, panneau de droite). En viétalonnage du capteur vo produit une trace similaire à celle du capteur ex vivo. Cependant, ce capteur détecte réductrice à la place des courants oxydantes et en tant que tel le courant produit est négatif. Calibration de ces capteurs produit également un ajustement linéaire dans une plage de 0,3 à 80 um (figure 7A panneau de droite). Spécificité du capteur in vivo à l&#39;ATP par rapport aux autres produits de la purine est représenté sur la figure 7B. L&#39;approche décrite ici nous permet de mesurer les deux niveaux de base de substances endogènes et changements aigus en réponse à la drogue perfusion 12. Les changements de concentration interstitielle endogène de H 2 O 2 dans les rats résistant au sel et le sel photosensible représenté sur la figure 11 sont Ang II-induite. Pour ces expériences, les reins fraîchement isolées à partir de Sprague Dawley (SD) ou (SS) Dahl rats sensibles au sel ont été perfuses avec 1 uM Ang II sous flux laminaire constant (650 pl / min). Comme shoWN à la figure 11, Ang II induit la libération aiguë de H 2 O 2 dans les reins de rats SD et SS. Cependant, l&#39;amplitude maximale de chaque réponse a été significativement plus élevée chez les rats SS, en particulier lorsque les animaux ont été nourris avec un régime riche en sel 12. Représenté sur la figure 12 est une application représentant des biocapteurs in vivo. L&#39;infusion de la catalase (5 ug / ml) bloque complètement le signal H 2 O 2 détectée par le capteur biologique. Ces expériences illustrent l&#39;utilisation de biocapteurs enzymatiques spécifiques combinées avec la technique ampérométrique pour la détection des niveaux de base de substances endogènes et de mesures en temps réel de leur libération en réponse à une intervention pharmacologique. D&#39;autres applications de cette approche pour étudier le rôle de la signalisation purinergique et le peroxyde d&#39;hydrogène permettra d&#39;améliorer notre connaissance et la compréhension de pathologies rénales comme l&#39;hypertension sensible au sel, boeuf rénalele stress idative et de maladie rénale chronique. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma des Protocoles. Calibrage avec analyte d&#39;intérêt et de tester sa spécificité est faite immédiatement avant le début des expériences. Le protocole in vivo devrait être suivie pour des expériences physiologiques complexes et ex vivo pour les applications pharmacologiques. Calibration de l&#39;expérience post devrait être fait et pris en compte lors de l&#39;analyse de données. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig2.jpg" /> Figure 2. Capteur enzymatique microélectrodes. Les deuxtailles de capteurs utilisés pour des applications ex vivo sont présentés, 50 um et 125 um diamètres. Chaque fil de la sonde pénètre dans un tube capillaire pour se connecter à un connecteur d&#39;extrémité de l&#39;or (non représenté). Encart montre une pointe de capteur revêtue d&#39;enzymes pour la détection de l&#39;ATP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig3.jpg" /> Figure 3. Double Potentiostat Channel. Les canaux de potentiostat marqués CH1 et CH2. 1) CH1 la connexion du capteur de l&#39;ATP et 2) CH2 Le capteur connexion 3) connexions nulles qui sont couplés électriquement à l&#39;électrode de référence. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig4.jpg" /> Figure 4. Configuration du capteur. L&#39;acquisition de données est effectué dans une cage de Faraday pour réduire le bruit électrique et sur ​​une table de laboratoire de haute performance pour une surface de travail exempt de vibrations. 1) Une table chirurgicale à température contrôlée est utilisé pour maintenir la température du corps de l&#39;animal au cours d&#39;expériences physiologiques 2) les micromanipulateurs sont attachés à des adaptateurs de montage magnétique pour un positionnement souple des capteurs lors de l&#39;expérience 3) Une source de lumière est nécessaire pour les procédures chirurgicales et l&#39;insertion du capteur 4 ) canal double potentiostat 5) de support pour les capteurs. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> p_upload / 53059 / 53059fig5.jpg &quot;/&gt; Figure 5. Voltamétrie cyclique. Pour études ex vivo, capteur voltamétrie cyclique est effectuée pendant 10 cycles entre -0,5 et 0,5 V avant le protocole de calibration. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig6.jpg" /> Figure 6. Amperometry étalonnage pour ex vivo. (A) d&#39;étalonnage utilise l&#39;addition de concentrations d&#39;ATP connus de la solution de bain. Les valeurs correspondantes ampérométriques enregistrées au niveau de l&#39;asymptote (trace noire). Les courants obtenus à créer une équation d&#39;étalonnage. Un exemple est montré sur le panneau droit. La trace rouge est la current Null du capteur qui réagit à la seule addition de H 2 O 2. (B) Le capteur Null est calibré avec l&#39;ajout de H 2 O 2 connu concentrations (flèches rouges) à la solution de bain et les asymptotes valeurs ampérométriques sont enregistrées (minces flèches noires). Ajout de la catalase à la solution de bain (épaisseur de flèche noire) se traduit par décroissance du courant rapide. Le panneau de droite montre l&#39;équation de calibrage du capteur Null. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig7.jpg" /> Figure 7. Amperometry étalonnage pour;. In Vivo L&#39;étalonnage du électrodes in vivo est effectué dans un mode similaire à celui détaillé dans les études in vivo, à l&#39;exception ex réactions de réduction provoque un courant inverse (polarité). (A) L&#39;ajout de concentrations connues ATP produit un courant ampérométrique sur le capteur de l&#39;ATP (trace noire) mais n&#39;a aucun effet sur ​​le capteur Null (trace rouge). L&#39;addition d&#39;apyrase éteint le courant du capteur de l&#39;ATP. (B) La spécificité de la sonde de l&#39;ATP est confirmée par l&#39;addition de 10 uM de différents agents purinergiques (UTP, UDP et adénosine). D&#39;autres applications de l&#39;ATP fournissent un courant ampérométrique détectable stable. (C) Microphotographie des capteurs in vivo basé sur un médiateur électrode enrobée d&#39;or. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figu</a>re. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig8.jpg" /> Figure 8. Coupes de rein. Dans les études in vivo, les reins sont détenus encore en utilisant les inoxydable tasses de rein de l&#39;acier indiquées. Deux tailles de tasses sont utilisés pour accueillir les reins variation de la taille. Ces coupes réduisent les artefacts de mouvement qui sont générés par la respiration de l&#39;animal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig8large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig9.jpg" /> Figure 9. ex vivo rein perfusé isolé et. Le rein isolé est placé dans un plat 1) Petri revêtue d&#39;une épaisse sifond de licone pour broche insertion 2) l&#39;artère rénale est canulée et attaché à une pompe à seringue pour perfusion constante au cours de l&#39;expérience 3), le capteur d&#39;ATP, 4) et le capteur Null sont insérés dans le rein 5) de l&#39;électrode de référence est placée près du rein immergé dans la solution de bain. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig9large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 10" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig10.jpg" /> Figure 10. In Vivo sang rein perfusé. (A) Le rein gauche est exposé et placé dans une coupelle de reins, le rein droit reste intact à l&#39;intérieur de l&#39;animal. Les deux capteurs sont insérés dans le rein. BSA: NaCl est perfusé via la veine jugulaire cathétérisé pour contrecarrer la perte de liquide provoquée by le grand exemple à mi-ligne incision (B) de l&#39;expérience in vivo avec un cathéter interstitielle implanté pour les applications pharmacologiques directs 1) le rein est détenu par un rein tasse 2) capteur ATP 3) capteur Null et 4) électrode de référence sont insérés dans la surface ventrale du rein 5) cathéter implanté dans le rein et attaché à une pompe péristaltique pour des infusions pharmacologiques laminaires. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig10large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 11" src="/files/ftp_upload/53059/53059fig11.jpg" /> Figure 11. Analyse ex vivo de H 2 </<html> sub&gt; O 2 dans le rein. Ang II perfusion provoque H 2 O 2 en sortie du cortex du rein du rat. (A) des changements en temps réel de la moyenne de H 2 O 2 de concentration (barres grises montrent erreur standard) sur un total de N = 8 applications (4 reins de rats 4 différentes). Des barres en haut représentent l&#39;application Ang II. (B) Le H 2 O 2 maximale des valeurs de concentration d&#39;amplitude pendant Ang II perfusion pour Sprague Dawley (SD) et (SS) rats sensibles au sel Dahl nourris avec un régime alimentaire riche en sel et faibles, respectivement. * - P &lt;0,05 par rapport rats SD. Le chiffre est adapté de la référence 12 avec la permission. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig11large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> /files/ftp_upload/53059/53059fig12.jpg &quot;/&gt; Figure 12. Analyse in vivo de H 2 O 2. Exemple de l&#39;évaluation in vivo de H 2 O 2 interstitiel concentration dans la moelle d&#39;un rat SS nourris avec un régime pauvre en sel (comme représenté sur la Figure 10B). L&#39;application de la catalase interstitiel par l&#39;intermédiaire d&#39;un cathéter implanté à l&#39;intervalle de 5 min a produit un blocage complet de l&#39;H 2 O 2 de signal dans la médullaire rénale. Réduction de la catalase, de lavage par le flux sanguin rénal, a donné lieu à une reprise partielle du signal, qui a de nouveau été bloqué par une application catalase supplémentaire (10 min). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53059/53059fig12large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney.

Utilisation des Biocapteurs pour quantifier enzymatique endogène ATP ou H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt; Dans le rein

Enzymatic microelectrode biosensors have been widely used to measure extracellular signaling in real-time. Most of their use has been limited to brain ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Use of Enzymatic Biosensors to Quantify Endogenous ATP or H2O2 in the Kidney

11.8K vues.  Medical College of Wisconsin. Enzymatic microelectrode biosensors enable real-time measurements of extracellular cell signaling in biologically-relevant concentrations. The following protocols extend the applications of biosensors to the ex vivo and in vivo detection of ATP and H2O2 in the kidney. 

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Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

L&#39;utilisation du kit de détection de protéase fluorescent pour déterminer l&#39;activité de protéase

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Recherche

Biologie

The use of SC1 (Pluripotin) to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and activation of the LIF/JAK/STAT3 pathway is not absolutely required to maintain the self-renewal state.2 The SC1 small molecule may be an economical alternative to LIF. SC1 functions through dual inhibition of Ras-GAP and ERK1.3 Illustration of its mechanism of action makes it a useful tool to study the fundamental molecular mechanism of self-renewal. Here we demonstrate the procedure for culturing mouse ES cells in the presence of SC1 and show that they are able to maintain self-renewal in the absence of LIF. Cells cultured with SC1 showed similar morphology compared to cells maintained with LIF. Both exhibited typical mouse ES morphology after five passages. Expression of typical pluripotency markers (Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1) was observed after five passages in the presence of SC1. Furthermore, SC1 caused no overt toxicity on mouse ES cells.

The use of SC1 Pluripotin to Support mESC Self-renewal in the Absence of LIF

SC1 functions through dual inhibition of Ras- GAP and ERK1. We tested the function of SC1 in supporting mouse ES cell self-renewal in the absence of LIF and showed that SC1 is able to maintain self-renewal of mouse ES cell cultures.

Mouse embryonic stem (ES) cells are conventionally cultured with Leukemia Inhibitory Factor (LIF) to maintain self-renewal.1 However, LIF is expensive and ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection du rein Zebrafish adultes

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET microscopie pour Surveillance en temps réel des événements de signalisation dans les cellules vivantes en utilisant Biocapteurs unimoléculaires

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse de néphron Composition et fonction du rein poisson zèbre adulte

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Néphrotoxine microinjection dans Zebrafish au Modèle lésion rénale aiguë

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Mesure de l’activité enzymatique Lactase dans le laboratoire d’enseignement

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...