Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

El objetivo general de este ensayo es administrar un enfoque múltiple para la detección simultánea de virus respiratorios que circulan comúnmente, como el SARS-CoV-2, el MERS, la influenza A y la influenza B. Las tecnologías predominantes que impulsan los avances en nuestro campo incluyen CRISPR, ensayos de aminoácidos de flujo lateral, sensores biomoleculares basados en papel, pruebas Sherlock en una olla, aptámeros de ADN y RT-qPCR múltiplex integrada con amplificación isotérmica mediada por bucles. LÁMPARA. Sin embargo, la RT-qPCR multiplex es la más sensible, la más común y es el estándar de oro para el diagnóstico de varios virus. El desafío experimental actual es establecer un protocolo que se pueda utilizar para detectar copias de ARN de tan solo 10 copias.

Utilizamos un kit interno de RT-qPCR para el ensayo, que es rentable y en tiempo y costo. Para comenzar, prepare el tampón 2x para RT-qPCR en agua libre de ADN/ARN Almacene el tampón a menos 20 grados centígrados hasta su uso posterior. A continuación, mezcle los cebadores y las sondas en un tubo de 1,5 mililitros.

Aumente el volumen con tampón de elución, luego almacene el tubo a menos 20 grados centígrados. Prepare una mezcla de enzimas con taq polimerasa y MMLV-RT en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. Compensar el volumen con tampón de almacenamiento de polimerasa taq.

Ahora vuelva a suspender los ARN sintéticos virales en tubos separados con 100 microlitros de tampón Tris-EDTA para hacer existencias de 10 a la sexta copia de ARN por microlitro. Para mezclar las existencias del virus, agregue cinco microlitros de SARS-CoV-2, influenza A y B a 50 microlitros de tampón Tris-EDTA. Del mismo modo, mezcle el SARS-CoV-2 y el MERS-CoV para obtener una segunda mezcla viral.

Diluir ambas mezclas diez veces para obtener una dilución final de 10 copias de ARN por microlitro. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos, pipetee 2x tampón, cebador, enzima, agua libre de ADN/ARN y las mezclas de ARN correspondientes. Selle la placa con un sello de placa adhesiva.

A continuación, centrifugar la placa durante un minuto para recoger el líquido en el fondo del pozo. A continuación, programe la máquina de PCR para que acepte el tipo de bloque rápido de 96 pocillos con el tipo experimental configurado en la curva estándar. Establezca los reactivos en reactivos TaqMan y seleccione las propiedades de ejecución estándar.

Defina las dianas genéticas y el colorante reportero. A continuación, defina los nombres de las muestras para cada reacción que se va a probar y asigne objetivos y muestras al diseño de la placa. Ahora introduzca el programa de ciclo en el instrumento.

Transfiera la placa a la máquina QPCR en tiempo real en la orientación correcta y presione ejecutar para iniciar el ciclo. Elija la ubicación del archivo para guardar los datos experimentales. A continuación, examine los gráficos de amplificación proporcionados por el programa QPCR.

Los dos kits desarrollados fueron capaces de amplificar con éxito los tres genes diana simultáneamente, con tan solo 10 copias de ARN por reacción. Las eficiencias de amplificación para todas las titulaciones virales estuvieron por encima del 99%