Este método facilitará la investigación sobre la reproducción sexual en Arabidopsis al permitir la observación de interacciones de gametofitos con alta eficiencia y con un alto número de tamaño de muestra por sesión de imagen. La principal ventaja de esta técnica es que al mantener los óvulos en el tabique, la cantidad y la receptividad de los óvulos aumenta considerablemente con respecto a los métodos anteriores. La técnica de disección puede ser inicialmente difícil y requiere una mano firme.
Por lo tanto, se recomienda practicar varias veces en pistilos castrados antes de comenzar con el experimento. Comience preparando el medio de germinación del polen como se explica en el texto. Después de que el agar esté completamente derretido, pipetear 130 microlitros del medio en el pozo de 14 milímetros de un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros.
Gire el plato hasta que el medio cubra el pozo. Aspire 40 microlitros de medio desde el centro del plato con una pipeta, dejando 90 microlitros de medio. Para garantizar un enfriamiento uniforme del medio, enfríe el plato en un bloque de aluminio en una cámara de humedad antes de almacenar los platos a cuatro grados centígrados durante la noche.
La mañana antes de la obtención de imágenes, elija plantas sanas de Arabidopsis que recientemente han comenzado a producir como donantes de tabique y donantes de estigma. Retire las flores más viejas en la inflorescencia antes de castrar las flores donantes de tabique 12B de tres etapas y las flores donantes de estigma de etapa 12B de 12 etapas eliminando sus estambres, sépalos y pétalos. Por la mañana, 24 horas más tarde, poliniza a los donantes de estigma con las flores donantes de polen que están derramando polen fácilmente.
La polinización es completa cuando los estigmas están casi completamente cubiertos de polen. 30 minutos después de la polinización, retire un pistilo donante de tabique sano y maduro en el pedículo y colóquelo en una cinta adhesiva fresca de doble cara montada en un portaobjetos de vidrio con el estigma pegado justo al borde de la cinta. Fije el pistilo firmemente en la cinta presionando suavemente sobre el pedículo y a lo largo del ovario con la parte posterior de una nueva aguja de jeringa de insulina.
Retire los restos de sépalo, pétalo y estambre sobrantes de la emasculación. Bajo un estereoscopio, use una aguja de jeringa de insulina para hacer dos cortes por carpelo en la unión estilo-ovario y la unión ovario-pedículo. Luego haga cortes poco profundos a lo largo del tabique de cada carpelo y retire las paredes del ovario sobre la cinta, exponiendo los óvulos.
Deslice la aguja suavemente entre los dos septos para cortar la ciruela a lo largo de toda la longitud del pistilo sin alterar los óvulos. Luego corte el tabique superior cerca del estilo para que todo el tabique se levante. Luego, retire el tabique del pedículo con fórceps.
Coloque el tabique lo más plano posible sobre el medio con las micropilas de los óvulos hacia arriba. Luego presione el tabique suavemente hasta que los óvulos estén ligeramente incrustados en el medio. Coloque los pistilos donantes de estigma polinizados en una cinta adhesiva fresca de doble cara montada en un portaobjetos de vidrio de modo que la unión estilo ovario quede fuera del borde de la cinta.
Corte el estilo hacia abajo con una hoja de afeitar y levántelo con el estigma unido a la hoja. Retire el estigma de la cuchilla con una aguja de jeringa de insulina y colóquela plana aproximadamente a 250 a 300 micrómetros de los óvulos. Transfiera hasta 12 estigmas, colocando dos a cada lado de cada tabique.
Después de incubar en una cámara de humedad en el microscopio mantenida al 92% de humedad relativa en 21 grados centígrados, el plato está listo para la obtención de imágenes. Enfoca las muestras bajo campo claro a una intensidad de luz baja y, a continuación, cambia a luz fluorescente. A continuación, marque las áreas de la muestra en la descripción general del escenario de las que se va a obtener una imagen.
Una vez hecho esto, comience a obtener imágenes utilizando un esquema de adquisición de varias etapas con una función de enfoque automático al comienzo de cada área de visión general. Aproximadamente de siete a nueve horas después de la incubación, verifique que los tubos de polen hayan sido atraídos y recibidos por los óvulos. La recepción exitosa del tubo polínico muestra una explosión explosiva del tubo polínico en la micropila de óvulos.
Cuando haya terminado, detenga la adquisición. Se realizaron ocho réplicas técnicas del método de óvulos extirpados semi in vitro y se calificaron para una recepción exitosa del tubo polínico. Los cuadrados verdes muestran una recepción exitosa y los cuadrados rojos muestran una recepción defectuosa.
Estos experimentos revelaron que alrededor del 28% de los óvulos muestran una explosión explosiva del tubo polínico, lo que resulta en una eficiencia que oscila entre aproximadamente el 10 y el 50%. Cinco réplicas técnicas de este método mostraron que aproximadamente el 79% de los óvulos que atraen tubos polínicos muestran una explosión explosiva del tubo polínico, lo que resulta en una eficiencia que varía de aproximadamente 70 a 100% Tras la ruptura del tubo polínico, se observó que el núcleo del sinérgico receptivo se degradaba al mismo tiempo con una resolución de un minuto. Después de la cariogamia, se observó la migración del núcleo del óvulo hacia la micropila.
Tanto la sinérgica izquierda como la derecha fueron capaces de servir como sinérgicas receptivas. Los factores críticos a los que prestar atención para tener éxito con este método son la estadificación, el uso de medio recién preparado, la incorporación de los óvulos en el medio, el mantenimiento de una humedad alta y la garantía de una baja fototoxicidad. También se puede combinar esta técnica con imágenes de excitación de dos fotones para una observación más cercana de los cambios fisiológicos y citológicos que ocurren durante las interacciones de gametofitos.
También se puede combinar esto con microscopía electrónica fijando los óvulos.
