Nuestro protocolo es un método simplificado que permite a los investigadores visualizar los pasos tempranos de infección de tipo salvaje y mutantes fúngicos genéticos sin el uso de equipos costosos. La principal ventaja de esta técnica es el uso de suministros básicos de laboratorio para responder preguntas biológicas complejas y para la detección rápida de mutantes fúngicos para su posterior análisis. Una parte difícil de esta técnica es el tratamiento de la vaina.
La vaina es una capa delgada de células que pueden dañarse fácilmente, por lo que un manejo cuidadoso es esencial para un experimento exitoso. Para comenzar, seleccione la cebada cultivada hasta la segunda etapa de hoja. Y usando tijeras estériles, corte la planta de cebada justo por encima de la línea del suelo.
Usando fórceps y un bisturí, corte cuidadosamente la vaina de la primera hoja que está abierta longitudinalmente. Y usando los fórceps, retírelo de la base de la segunda hoja. Usando un bisturí, corte la mayor parte de la primera hoja de la vaina, dejando solo 0.5 pulgadas del tejido de la hoja para montar.
Coloque la primera hoja plana en una placa de Petri estéril de 60 milímetros que contenga una toalla de papel húmeda para mantener la humedad dentro de la placa. Pegue el tejido de la hoja en el fondo de la placa de Petri. Seleccione una placa de cultivo de oryzae Magnaporthe de nueve a 12 días de edad y agréguele de 0.5 a dos mililitros de agua estéril.
Usando un bucle de inoculación estéril, raspe suavemente el micelio para liberar los conidios adjuntos. Pipetea cuidadosamente la suspensión conidial en un tubo de microcentrífuga que contenga un pequeño trozo de tela de queso para filtrar cualquier trozo grande de micelio de la suspensión conidial. Si es necesario, diluya la concentración de esporas con agua estéril a cinco veces 10 a la cuarta esporas por mililitro, ya que una concentración demasiado alta hace que las imágenes de los sitios de infección individuales sean un desafío.
Dependiendo del tamaño de la vaina, pipetear cuidadosamente de 25 a 50 microlitros de la suspensión conidial dentro de la vaina de la hoja enrollada. A continuación, llene cuatro o cinco vasos de precipitados de 500 mililitros con agua destilada doble y caliente hasta que cocine al vapor. Sostenga la tapa de la placa de Petri sobre uno de los vasos humeantes para atrapar la humedad dentro del plato.
Apile las placas de la vaina de las hojas infectadas y rodéelas con los vasos calientes restantes, ya que crea un ambiente húmedo y húmedo para que las esporas germinen. Proteja esta configuración de la luz cubriéndola con una caja de goma o plástico de color sólido y dejándola sin interrupciones durante 48 horas o el punto de tiempo deseado para la obtención de imágenes. Prepare la mancha mezclando ácido acético al 45% recién diluido y azul de tripano al 0,1%.
Alícuota un mililitro de la solución de colorante en tubos de microcentrífuga. Con un bisturí, corte cuidadosamente la vaina de la hoja lejos de la cinta. Con fórceps, coloque la vaina en el tubo de microcentrífuga y asegúrese de que esté completamente sumergida en la solución de colorante.
Deje reposar los tubos durante dos horas en un bloque de calor de 40 grados centígrados o baño de agua para que el tinte penetre en la hoja. A continuación, enjuague cuidadosamente las vainas de las hojas tres veces con glicerol fresco al 60% para eliminar el tinte adicional. Mantenga la vaina en glicerol hasta que esté lista para montarla en portaobjetos.
Coloque la funda en un portaobjetos de vidrio limpio y agregue unas gotas de 60% de glicerol. Usando un microscopio de disección y dos pares de fórceps, desenrolle cuidadosamente la vaina, dejando el centro inoculado hacia arriba. Sosteniendo la vaina abierta con los fórceps, coloque el cubreobjetos en la parte superior para evitar que la vaina se enrosque y bloquee el sitio de infección.
Selle el papel de la cubierta con esmalte de uñas para el almacenamiento a largo plazo o cinta adhesiva para el almacenamiento a corto plazo. Observe las diapositivas bajo un microscopio de luz compuesta. Tome imágenes básicas con un teléfono inteligente montando un adaptador de teléfono celular en el microscopio.
Para dispositivos Android, ajuste la configuración de la aplicación de la cámara para que se desactive, desactive la toma superior, deshabilite el ajuste automático de brillo y sombras y establezca la resolución de la foto en completa. Después de montar el teléfono celular, tome una imagen de un micrómetro a escala con un objetivo deseado para adquirir los datos. Ajusta el zoom del teléfono a 2,5x y mantenlo uniforme para mantener un tamaño de píxel constante.
El centro de la vaina alberga la mayor concentración de esporas y appressoria infectante. Por lo tanto, apunte a nueve a 12 imágenes de cada vaina para obtener números significativos para el análisis estadístico. Los sitios de infección de la vaina se visualizaron utilizando un adaptador de microscopio para teléfonos inteligentes y teléfonos inteligentes después de la tinción con azul de tripano.
El calor y el ácido acético en el procedimiento de tinción suavizan suavemente el tejido de la hoja. Los enjuagues posteriores a la tinción en glicerol al 60% no solo eliminan el exceso de mancha, sino que ayudan a reducir la dispersión de la luz causada por la hoja y mejoran la calidad de la imagen. Las desviaciones del protocolo de tinción pueden dar lugar a resultados subóptimos, como se muestra aquí.
La cebada infectada con 4091 tipo salvaje produjo células infectadas con éxito identificadas por la presencia de hifas infectadas dentro del tejido de la vaina de la hoja. En el caso de la infección mutante J99A, se observó un desarrollo exitoso de appressoria y clavijas de penetración, pero no produjo hifas invasivas. El tiempo es importante para los ensayos basados en infecciones.
Las plantas envejecidas adecuadamente y las esporas de hongos son esenciales para el éxito. En este estudio, observamos la presencia o ausencia de las estructuras de infección. Experimentos adicionales podrían responder preguntas sobre el fenotipo de la estructura de la infección y la de las hifas invasoras.
Nuestra metodología no es nueva, sino una versión simplificada y accesible de un experimento más complejo y costoso.
