El soporte impreso en 3D utilizado en este protocolo nos permite monitorear la señalización celular a corto plazo y los eventos de migración celular a largo plazo en córneas heridas en tiempo real. Al mantener el globo intacto, viable e inmóvil, este protocolo produce imágenes en vivo de alta calidad de las células corneales, incluidos el epitelio y los nervios. El soporte impreso en 3D podría modificarse fácilmente para globos terráqueos de varios tamaños y especies.
También podemos orientar los ojos de manera diferente para obtener imágenes de otras regiones o realizar experimentos de nano indentación. Para empezar, después de retirar la cabeza de un ratón sacrificado, colóquelo inmediatamente sobre hielo para preservar la viabilidad del tejido. Luego enuclea los globos apoyándolos, usando pinzas.
Y recorte el nervio óptico usando tijeras de disección justo debajo de donde lo sostienen las pinzas. Incubar los globos en dos mililitros del medio en una placa de cultivo celular P-35, incluyendo un indicador de calcio y/o tinción de membrana celular durante una hora en una incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono con condiciones de poca luz, asegurando que los globos estén sumergidos en el medio de tinción para una tinción uniforme. Para adherir los soportes a un deslizamiento de cubierta inferior de vidrio limpio, lave el soporte en etanol al 70% y coloque pegamento en el soporte.
Luego, adhiera el soporte al deslizamiento de la cubierta inferior de vidrio, asegurándose de que no haya pegamento dentro del área interna del soporte, ya que el pegamento puede fluorescer, lo que complica las imágenes. Después de que el pegamento se solidifique, confirme que el soporte esté seguro contra el cubreobjetos. Retire los globos de la solución de tinción utilizando los goteros estériles, teniendo cuidado de evitar daños tisulares en la región de interés.
Lave los globos durante cinco minutos a temperatura ambiente, utilizando solución salina tamponada con fosfato estéril para eliminar el exceso de manchas y coloque los globos en el medio para transportarlos al microscopio. Para enrollar los globos con una aguja estéril de calibre 25 en la región de interés, levante y sostenga el globo de la parte posterior del ojo, usando un gotero estéril para mantener el globo estable y evitar que ruede. Para una herida por rasguño, mueva suavemente una aguja estéril de calibre 25 a través de la córnea expuesta o presione suavemente la aguja directamente en la córnea central para una herida punzante, asegurándose de que la herida no perfore la membrana basal corneal.
Coloque la córnea o la región limbal sobre el cubreobjetos en el área interna del soporte, mientras confirma que el globo está colocado correctamente y que el sitio de interés está en contacto con el cubreobjetos de vidrio. Estabilizar utilizando la cubierta impresa en 3D adherida al soporte, utilizando pegamento. Y no intente extraer el globo, ya que esto puede causar daño tisular.
Encienda el microscopio y ajuste la cámara ambiental a 35 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y verifique la cámara humidificada. Coloque el soporte de la cubierta y el globo estabilizado en la etapa del microscopio dentro de la cámara ambiental y la imagen, utilizando técnicas de imágenes de células vivas. Mediante el veterinario, aplique medios de crecimiento adicionales en el cubreobjetos para evitar la deshidratación y mantener la viabilidad del tejido, asegurando que haya suficiente medio en el pozo para cubrir el globo en el soporte.
Comience los experimentos utilizando técnicas de imágenes de células vivas, mientras usa configuraciones de láser de baja potencia para preservar el tejido y prevenir el daño tisular y los objetivos apropiados para experimentos de larga duración. Grabe y guarde datos en el formato de archivo preferido de archivos CZI para la grabación de datos. Se obtuvieron datos de imágenes de alta calidad de la estructura multicapa para la córnea X vivo, estabilizados con un soporte impreso en 3D, que demuestra eventos de señalización de calcio en las capas apical, basal y estromal de la córnea.
Se obtuvieron imágenes Z-stack de una córnea, inmovilizada en el soporte impreso en 3D, en una herida por rasguño para visualizar las membranas celulares y la señalización de calcio a lo largo de las capas de la córnea y la movilización de calcio en diferentes planos Z. Se realizó un experimento de serie temporal de una córnea para estudiar la migración celular hacia el lecho de la herida durante la respuesta de curación, revelando poco movimiento del globo en las direcciones X, Y o Z. Se observó que al colocar el globo en el soporte, se pueden visualizar diferentes regiones de la córnea, tanto en la región limbal central como en la corneal.
Este protocolo nos permite obtener imágenes de ojos de modelos de enfermedades que exhiben diferencias en la cicatrización de heridas. Podemos caracterizar aberraciones en la señalización celular y la motilidad en tejido vivo.
