Nuestro protocolo proporciona un mapeo 2D detallado de la vida útil de la fosforescencia y la concentración de oxígeno en objetos macroscópicos, particularmente tejido animal vivo y animales enteros, por medio de sondas dedicadas y materiales de detección. Esta información es importante para muchas áreas de investigación. Nuestro protocolo utiliza un módulo de imágenes integrado y compacto que funciona en modo TCSPC y proporciona una visualización fácil y precisa de la vida útil y la distribución de oxígeno en muestras biológicas complejas, como el tejido vital.
Tome el adaptador Cricket e inspecciónelo desde diferentes lados. Retire el adaptador de montura C frontal para mostrar el intensificador de PP0360EF Photonis alojado en el Cricket y, a continuación, vuelva a colocar el adaptador de montura C. Retire el adaptador de montura C frontal del Cricket e inserte el filtro de emisión de 650 más/menos 50 nanómetros.
Arreglarlo volviendo a colocar la montura C. Luego, conecte el módulo de cámara TPX de tres cámaras a la parte posterior del módulo Cricket a través de sus adaptadores de anillo. Conecte la lente a la parte frontal del módulo Cricket a través del adaptador de montura C.
Conecte el LED a una fuente de alimentación y a un generador de pulsos. Ahora, monte el LED súper brillante de 390 nanómetros en un poste conectado a una placa de pruebas dentro de la caja negra. Encienda el LED y enfóquelo para garantizar una excitación efectiva y uniforme de la muestra que se está fotografiando.
Monte el conjunto de la cámara en la parte superior de la caja negra óptica hacia abajo hacia el escenario donde se tomarán las imágenes. Conecte la cámara y el LED a generadores de dos pulsos y a un osciloscopio de cuatro canales. Utilizando los ajustes del osciloscopio y los generadores de pulsos, sincronice los pulsos enviados a la cámara y al LED.
Utilice el cable especial y el enchufe de la unidad Cricket para conectar el intensificador a una fuente de alimentación estándar y ajustar la ganancia a 2,7 voltios. Coloque la muestra delante de la lente de la cámara. A continuación, encienda la cámara y todos los módulos eléctricos, excepto el intensificador.
Active el software SOFI para ajustar los parámetros operativos, como el enfoque y la alineación de muestras. En los módulos, establezca la exposición del fotograma en 0,01 segundos. Seleccione Fotogramas infinitos y establezca el modo de operación de píxeles en tiempo por encima del umbral.
Luego, vaya a Vista previa y seleccione Módulo activo para abrir la ventana de marcos Medipix / Timepix. En el siguiente paso, después de iniciar la grabación, ajuste la escala de color y gire la imagen a la orientación deseada. Después de eso, apague las luces de la habitación y encienda el intensificador.
Enfoque la óptica de la cámara en la etapa de muestra con las capacidades de enfoque de la lente y el adaptador Cricket para generar imágenes claras de muestras con buen contraste y brillo. Una vez completado el enfoque, cierre el software SOFI. Luego, vaya al terminal, ejecute los comandos del software de diseño personalizado para adquirir los datos en bruto en formato binario y cierre el terminal.
Abra un nuevo terminal para procesar los datos adquiridos. Cargue el archivo de datos y ejecute el reductor de datos. Analice los datos posteriores al proceso con un programa dedicado escrito en lenguaje C que escribirá los datos en un archivo de imagen ICS.
Posteriormente, abra los archivos de imagen ICS utilizando el software Time Resolved Imaging disponible gratuitamente y use dos funciones exponenciales para adaptarse a las desintegraciones de fosforescencia. Por último, abra el Instalado. Archivos de imagen ICS con el software de análisis de imágenes disponible.
Genere imágenes de vida útil de fosforescencia utilizando tablas de búsqueda y codifique en pseudo escala de color. Utilice la función Medir para calcular los valores de vida útil promedio para toda la imagen o regiones de interés. Se muestran imágenes de microscopía de imágenes de intensidad de fosforescencia y vida útil de la fosforescencia del punto sensor de colorante octaetilporfirina de platino en los estados oxigenado y desoxigenado.
Asegúrese de que el filtro de emisión correcto esté montado dentro del Cricket y que se utilicen los ajustes correctos de LED, conexiones de cable y pulsos. Actualmente, este protocolo se limita a modelos animales, pero potencialmente se puede aplicar para diagnosticar y tratar estados patológicos asociados con la hipoxia tisular, como cáncer, accidente cerebrovascular e inflamación.
