Este protocolo utiliza irradiación de luz violeta visible para inducir fotólisis de mononucleótidos de flavina. Esto produce una gran cantidad de radicales libres, que inhiben las bacterias patógenas como Staphylococcus aureus y E. coli. Hemos probado el mononucleótido de flavina como un fotosensibilizador apropiado.
En este protocolo, utilizamos luz violeta visible que es segura y no requiere equipos costosos. Este método se puede utilizar para la terapia de la piel lesionada o tejidos subcutáneos infectados mediante la inserción de una fibra óptica para la iluminación. También se puede aplicar a la práctica de saneamiento en la industria alimentaria.
Demostrando el procedimiento estará Tang-Yu Chen, un estudiante graduado de mi laboratorio Para comenzar, monte seis diodos emisores de luz de 12 voltios cada uno en el interior de un vaso de plástico opaco. Tome un tubo de ensayo de vidrio con un diámetro de 13 milímetros y una altura de 100 milímetros y agregue los reactivos al tubo. Asegure los tubos en la parte superior de la taza y coloque esta configuración a una temperatura constante de 25 tres grados centígrados.
Monitoree y registre la temperatura de las unidades de prueba a lo largo de las reacciones fotolíticas mediante un termómetro infrarrojo. A continuación, prepare una solución de FMN 0.1 milimolar en tampón de fosfato de potasio de 100 milimolares a pH 7.8. Exponga tres mililitros de muestras de FMN a luz azul, verde, roja o violeta durante cinco minutos.
En paralelo, mantenga tres mililitros de solución de FMN en la oscuridad como control. Coloque la muestra en un espectrofotómetro UV visible y registre la absorbancia de las muestras irradiadas en el rango de 250 a 750 nanómetros. Para prepararse para la detección de radicales superóxido, primero agregue 109.3 miligramos de L-metionina a 73.3 mililitros de tampón fosfato de 100 milimolares a pH 7.8.
En la solución, agregue 10 miligramos de polvo de NBT y 1.5 mililitros de FMN de 0.117 milimolar. Exponga un mililitro de la solución de reacción a la luz LED azul o violeta durante uno a cinco minutos. Registre la absorbancia de 516 nanómetros para detectar formazan, que se produce por la reacción fotoquímica de NBT.
Inocular una colonia de Staphylococcus aureus en 10 mililitros de caldo de lisogenia en un tubo de ensayo con tapa de rosca de 15 mililitros. Cultive el cultivo a 37 grados centígrados durante 16 horas en una coctelera. Transfiera 0,5 mililitros del cultivo a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Diluir el cultivo a una densidad óptica de 0,5 a 600 nanómetros añadiendo agua esterilizada. Luego, transfiera 0.5 mililitros del cultivo a un tubo de centrífuga de 1.5 mililitros. Centrifugar a 14, 000 G durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
Agregue un mililitro de solución tamponada de FMN a la gránula y al vórtice de la célula. Para el control irradiado, añadir un mililitro de tampón fosfato. Transfiera un mililitro de solución celular bacteriana que contenga FMN 30-micromolar y tampón fosfato en tubos de vidrio.
Colóquelos para una radiación bajo luz violeta a 10 vatios por metro cuadrado durante 30 minutos. Luego, transfiera un mililitro de solución celular bacteriana que contenga FMN 30-60 y 120 micromolares y tampón fosfato en tubos de vidrio. Irradiar con luz azul durante 120 minutos a 20 vatios por metro cuadrado.
Además, irradie un tubo que contenga un mililitro de FMN 120 micromolares durante 60 minutos. Después de la irradiación, agregue 0,2 mililitros de la solución de reacción a una placa de agar luria. Extienda la solución con una varilla de vidrio en forma de L e incube durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, calcule el recuento viable de placas y la tasa de inactivación de Staphylococcus aureus. Prepare las muestras de Staphylococcus aureus como se describió anteriormente para obtener un pellet celular. A 75 mililitros de tampón fosfato agregue 0.1093 gramos de L-metionina, 0.1 gramos de NBT y 25 mililitros de solución de FMN.
Agregue un mililitro de cada solución de reactivo con concentraciones variables de FMN a los gránulos y vórtices celulares. Irradiar las soluciones bajo luz violeta a 10 vatios por metro cuadrado durante 10 minutos. Centrifugar la mezcla a 14, 000 G durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
Resuspender el pellet en un mililitro de dimetilsulfóxido para extraer el NBT reducido. Registre la absorbancia a 560 nanómetros. La irradiación de FMN con luz verde y roja no mostró ningún efecto en los picos a 372 y 444 nanómetros en comparación con el control oscuro, mientras que la reducción en la absorbancia de FMN a 444 nanómetros se observó bajo luz azul y violeta, lo que indica un aumento de la fotólisis.
La detección de radicales superóxido formados durante la fotólisis FMN bajo luz azul o violeta se realizó mediante la reducción de NBT. El efecto fotoquímico de la FMN dependía del tiempo de irradiación. La fotólisis FMN mediante irradiación de luz azul o violeta dio lugar a una inactivación significativa de Staphylococcus aureus.
Se observó inactivación dependiente de la dosis para la irradiación de luz azul, con una inactivación del 97% lograda para FMN de 120 micromolares. Bajo luz violeta, se logró una tasa de inactivación del 96% para Staphylococcus aureus, con FMN 30-micromolar mostrando una mayor eficacia para la inactivación bacteriana. La reducción de NBT mostró que el efecto fotolítico de FMN bajo luz violeta en Staphylococcus aureus fue proporcional a la concentración de FMN.
En condiciones no tratadas, se indicó una menor abundancia de radicales superóxido por una baja absorbancia a 560 nanómetros, mientras que los valores de absorbancia más altos en el tratamiento con FMN mostraron una producción abundante de radicales superóxido, lo que resultó en un mayor efecto fotoquímico. Es fundamental tener una buena fuente de luz LED. El ancho espectral del régimen de luz violeta debe ser estrecho para evitar cualquier superposición con la absorción UV, ya que la radiación UV puede ser peligrosa.
Después del procedimiento, otros compuestos químicos como tetraciclina, doxiciclina, catequina y pueden ser probados para la fotólisis similar a FMN.
