Es un protocolo fácil y visualizado que demuestra el manejo de organoides del adenocarcinoma esofágico en dos procesos de subcultivo diferentes con y sin digestión unicelular. El protocolo estandarizado para subcultivar organoides de EAC en dos métodos diferentes puede ayudar a los investigadores a elegir técnicas apropiadas para diferentes aplicaciones posteriores en sus experimentos basados en EAC PDO. Al tratar con las DOP, es esencial prestar atención a los detalles en cada paso.
Un POE basado en equipos es crucial para la calidad de los POD. Demostrando el procedimiento estará uno de nuestros estudiantes de doctorado Ning Bo Fan y Lisa Raatz, asistente técnica del laboratorio. Precalentar una placa de 12 pocillos mediante incubación nocturna a 37 grados centígrados utilizando dióxido de carbono.
Si está disponible, use pocillos vacíos de una placa con el cultivo de organoides derivado del paciente. Incubar un volumen apropiado de gel ECM durante una hora en hielo para licuar. Coloque la solución de recuperación celular sobre hielo.
Retire la placa con PDO en crecimiento de la incubadora. Aspirar medio viejo usando una bomba de vacío. Agregue 500 microlitros por cúpula de solución de recuperación de células heladas en el pozo.
Desintegre el gel ECM mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo varias veces para fragmentar las cúpulas de gel ECM en trozos pequeños utilizando puntas de 1.000 microlitros con un orificio ancho. Combine la DOP, el gel ECM y la solución de recuperación celular de un máximo de dos pocillos y transfiéralo a un tubo de unión baja de cinco mililitros. Incuba este tubo en hielo durante 20 minutos.
Mezclar cada cinco minutos invirtiendo el tubo. Centrifuga el tubo a una velocidad de 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Si no hay un gránulo visible, retire cuidadosamente el sobrenadante con una bomba de vacío hasta que se alcance la fase que contiene la solución de DOP de gel ECM y agregue tres mililitros de solución de recuperación de células heladas.
Invierta el tubo varias veces e incube en hielo durante otros 10 minutos. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante cuidadosamente usando una bomba de vacío o una pipeta de 1.000 microlitros.
Trate de quitar el sobrenadante tanto como sea posible. Guarde el pellet de DOP en hielo. Retire las puntas de microlitros 201, 000 preenfriadas con un orificio ancho del congelador de menos 20 grados centígrados y colóquelas en un banco limpio.
Calcule 50 microlitros de gel ECM por cúpula planificada para la siembra, más 50 microlitros adicionales. Luego vuelva a suspender el pellet en gel ECM usando una punta de 1, 000 microlitros preenfriada y mezcle mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces. Retire la placa de 12 pocillos precalentada de la incubadora antes de sembrar las cúpulas.
Sembra las cúpulas que contienen 50 microlitros de gel ECM en la placa caliente. Incubar la placa a 37 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 20 a 30 minutos para solidificar el gel ECM. Agregue el medio DOP precalentado con cuidado sin perturbar las cúpulas.
Monitoree las PDO sembradas bajo el microscopio. Cultive las DOP durante 7 a 14 días hasta que se produzca la densidad y la morfología requeridas. Prepare el medio de digestión mezclando dos mililitros de TRIPSINA EDTA al 0,25% y 20 microlitros DNAase I para digerir los PDO cosechados de dos pozos.
Vuelva a suspender el pellet previamente preparado en un volumen apropiado de tripsina EDTA y DNAasa I precalentados al 0,25% y mézclelo unas 10 veces mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo utilizando una pipeta de 1.000 microlitros. Incubar durante 10 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora giratoria con una velocidad de rotación de un mínimo de 28 RPM. Prepare un tubo de 15 mililitros que contenga seis mililitros de solución inhibidora de tripsina de soja.
Después de la digestión, mezcle los PDO digeridos a fondo varias veces con una pipeta de 1.000 microlitros para interrumpir los DOP. Transfiera los PDO digeridos al tubo de 15 mililitros que contiene la solución de SDI para detener la digestión. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante cuidadosamente usando una bomba de vacío o una pipeta de 1.000 microlitros. Resuspend el pellet en un mililitro de medio basal. Determine la concentración celular y la viabilidad utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro.
Calcule el número de células de acuerdo con las cúpulas planificadas para la siembra, más una cúpula adicional, y transfiéralas a un tubo de unión baja fresco de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de 1.000 microlitros.
Agregue el volumen apropiado de gel ECM al pellet usando una punta de orificio de 1, 000 microlitros de ancho preenfriada. Mezclar mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces. Sembra los PDO digeridos en una placa de 12 pocillos como se demostró anteriormente.
Iniciar el proceso de criopreservación de DOP no digeridas con pellet previamente preparado. Utilice 500 microlitros de medio de congelación en frío para resuspendir el pellet de dos cúpulas y transferirlo a un vial criogénico. Congele las DOP durante la noche en el congelador utilizando un recipiente de congelación celular apropiado.
Transfiera las PDO congeladas a un congelador de menos 150 grados centígrados. Para la criopreservación de PDO digeridos, transfiera las células a un tubo de unión baja fresco de 1,5 mililitros. Centrifugar a 500 veces G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante cuidadosamente usando una pipeta de 1.000 microlitros. Vuelva a suspender el pellet en un medio de congelación de 500 microlitros y transfiéralo a un vial criogénico. Congele los DOP durante la noche en un congelador de menos 80 grados Celsius usando un recipiente de congelación celular apropiado y transfiéralos a un congelador de menos 150 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo.
El subcultivo sin digestión unicelular tarda menos tiempo en alcanzar una densidad comparable y conduce principalmente a estructuras compactas. En contraste, las PDO digeridas de una sola célula muestran estructuras con un núcleo hueco. La figura muestra la tinción de eosina de hematoxilina y la tinción inmunohistoquímica de PDO EAC incrustadas en parafina con estructuras compactas y huecas.
La pancitoquinatina permite la identificación de células tumorales epiteliales. La citoqueratina 7 resalta las células tumorales diferenciadas glandulares. La estructura compacta existe predominantemente en el cultivo no digerido, mientras que la estructura hueca es dominante en el cultivo que se sometió a la digestión unicelular.
El Ki67 destaca las poblaciones celulares con mayor proliferación celular. El Ki67 en rojo y el PanCK en verde se distribuyeron de manera similar entre el tejido primario de EAC, la estructura compacta de EAC PDO y la estructura hueca de EAC PDO. La figura muestra las características morfológicas de las DOP EAC en el primer día de recuperación de la población congelada con criopreservación basada en una sola célula y criopreservación basada en DOP no digerida.
Recomendamos hacer un plan de subcultura claro con anticipación. El control de la temperatura y el pipeteo suave son esenciales para el manejo correcto de los geles ECM al subculpir las DOP. Nuestro protocolo proporciona a los investigadores lo sustancial para mantener sus PDO de EAC de acuerdo con el propósito de su estudio para el análisis posterior, como el ensayo de detección de drogas, la citometría de flujo o el análisis histológico.
Esperamos que nuestro trabajo pueda ayudar a los investigadores de organoides a tomar decisiones rápidas y fáciles para el almacenamiento y subcultivo de organoides, particularmente para resultados sólidos de materiales derivados de pacientes en investigación traslacional.
