Este protocolo fomenta el uso de tejidos humanos primarios como un modelo clínicamente relevante para la investigación de la osteoartritis. La realización de análisis histológicos y de expresión génica en estos tejidos puede proporcionar nuevos conocimientos mecanicistas. Esta técnica estandariza los métodos para la identificación y el procesamiento de los componentes de la articulación de la rodilla humana.
Permite la extracción de ARN de alta calidad que cumple con los requisitos para los ensayos de expresión génica aguas abajo. Es difícil obtener ARN de alta calidad de los tejidos articulares enfermos, por lo que no se debe subestimar la importancia de pasos aparentemente insignificantes, como mantener todo limpio y fresco. Demostrando el procedimiento estarán Thomas Wilson, un investigador asociado y Navdeep Kaur, un becario postdoctoral de mi laboratorio.
Comience por identificar los tejidos duros, incluidos el cartílago, el hueso y el menisco y los tejidos blandos, incluida la almohadilla de grasa infrapatelar, el ligamento cruzado anterior, la membrana sinovial y el músculo oblicuo vasto medialis de la muestra en función de las diferencias en el tamaño, la forma, el color y la textura. Corte cada uno de los tejidos en tres secciones. Enjuague las secciones de tejido con PBS estéril para eliminar cualquier residuo o desecho.
Para la extracción de ARN, corte cada una de las tres secciones de tejido en cubos de aproximadamente uno a dos milímetros. Transfiera las piezas más pequeñas a un vial crio crio de dos mililitros. Después de asegurar las tapas herméticamente, congele los viales sumergiéndolos en nitrógeno líquido durante 30 segundos, luego transfiera el vial al congelador de menos 80 grados Celsius para su almacenamiento a largo plazo y repita este procedimiento para todos los tejidos.
Homogeneizar el tejido duro utilizando un mortero y mortero. Antes de la homogeneización, enfríe el mortero, el mortero y la espátula con nitrógeno líquido para evitar que la muestra se descongele. Procese solo una muestra a la vez.
Transfiera la muestra de tejido al mortero usando una espátula refrigerada. Vierta nitrógeno líquido sobre el tejido. Después de que el nitrógeno líquido se evapore, triture el tejido con un mortero.
Agregue repetidamente nitrógeno líquido mientras muele el tejido para obtener polvo de tejido fino. Transfiera el polvo de tejido fino en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros pre-enfriado sumergiéndolo en nitrógeno líquido durante 30 segundos. Agregue un mililitro de la solución de ácido helado guanidinio fenol a cada tubo e incube los tubos en hielo durante 20 minutos.
Antes de homogeneizar diferentes tejidos duros, limpie a fondo el mortero, el mortero y la espátula con etanol al 70%, luego con descontaminante RNasa, seguido de agua tratada con DEPC. Remoje el mortero, el mortero y la espátula en etanol al 70%, luego limpie cualquier líquido residual con un tejido limpio y sin pelusa. Homogeneizar el tejido blando utilizando el homogeneizador de tejidos.
Para desinfectar el homogeneizador, lave la sonda haciendo correr tubos de etanol al 70% y descontaminante RNasa durante 30 segundos por lavado, luego lávese con agua tratada con DEPC, seguido de un 70% adicional de etanol, cada uno durante 30 segundos. Limpie cualquier líquido residual con un pañuelo limpio y sin pelusa. Agregue un mililitro de solución de ácido guanidinio fenol a los tubos inferiores redondos de cinco mililitros preetitiquetas y transfiera la muestra de tejido al tubo.
Coloque el tubo sobre hielo durante todo el procedimiento y homogeneice el tejido durante un máximo de cinco pulsos 32, o hasta que el tejido se disuelva visualmente. Incubar el tejido homogeneizado en hielo hasta que se procesen todas las muestras de tejido. Desinfecte y limpie el homogeneizador antes de procesar la siguiente muestra de tejido.
Usando forrceps estériles, retire cualquier trozo de tejido presente en los dientes de la sonda. Incube todo el tejido homogeneizado en el hielo durante 20 minutos adicionales y luego transfiera la muestra de tejido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preetiquetado y preenfriado. Siete tejidos únicos de la articulación de la rodilla humana obtenidos de pacientes con osteoartritis se procesaron dentro de las cuatro horas posteriores a la extirpación quirúrgica.
Los tejidos fueron identificados visualmente y confirmados por tinción histológica de H&E. Las secciones de tejido duro teñidas de H&E, el cartílago articular, el hueso subcondral y el menisco se visualizaron a seis veces el aumento y 40 veces el aumento. Del mismo modo, las secciones de tejidos blandos teñidas de H&E, la almohadilla de grasa infrapatelar, el ligamento cruzado anterior, la membrana sinovial y el músculo oblicuo vasto medialis se visualizaron a seis veces la ampliación y luego a 40 veces la ampliación.
La evaluación de la calidad del ARN extraído indicó la presencia de muestras de alta calidad basadas en la integridad, el rendimiento y la pureza, así como muestras de baja calidad, lo que sugiere que, a pesar de utilizar un método optimizado, factores externos como la gravedad de la enfermedad pueden afectar la calidad del ARN en diferentes tejidos del mismo paciente. La identificación correcta de cada tipo de tejido es necesaria para permitir comparaciones intra e intersulares dentro y entre muestras de pacientes, especialmente dada la considerable heterogeneidad de los tejidos de la enfermedad primaria. Las tecnologías de secuenciación están evolucionando rápidamente, y el aislamiento de ARN de alta calidad es un requisito previo crítico para usar estas tecnologías para desentrañar los mecanismos subyacentes específicos del tejido en enfermedades complejas y crónicas como la osteoartritis.
