El protocolo de aislamiento de membrana plasmática a pequeña escala y la doble etiqueta mGFPHis proporcionan un método económico, rápido, confiable y fácil para caracterizar proteínas de membrana en el organismo modelo eucariota, Saccharomyces cerevisiae. La mayor ventaja de esta tecnología es la facilidad y velocidad con la que se pueden determinar los niveles de expresión de proteínas de membrana, las actividades del ATP y el detergente más adecuado para su purificación. Esta tecnología es muy fácil de usar.
Sin embargo, un punto importante a recordar es cosechar células como OD 600 de 2, lo que garantiza una baja contaminación mitocondrial y las mayores actividades posibles de ATPasa. Comience por precultivar una sola colonia de levadura en 10 mililitros de medio YPD a 30 grados Celsius durante siete a ocho horas a 200 rotaciones por minuto. Utilice 10 mililitros de pre cultivo para inocular 40 mililitros de medio YPD fresco.
Luego incubar las células a 30 grados Centígrados durante la noche a 200 rotaciones por minuto hasta que la densidad celular alcance un OD 600 de uno a tres. Al día siguiente, cosecha 40 unidades de densidad óptica, u ODU, de células logarítmicas de la cara mediante centrifugación a 4, 200 veces G por cinco minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a suspender y lavar las celdas con 40 mililitros de agua doble destilada estéril helada.
Repita el lavado con un mililitro de agua helada con centrifugación entre los pasos de lavado. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua estéril helada y transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros preenfriado sobre hielo. Cosecha las células a 3.300 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 500 microlitros de tampón homogeneizador recién suplementado con un milimolar fenal metil sulfa Neal fluoruro, o PMSF. Guarde la suspensión celular a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Descongelar las células en hielo durante aproximadamente una hora.
Luego agregue perlas de sílice heladas de 0,5 milímetros de diámetro a los 500 microlitros de la suspensión celular para alcanzar un volumen total de un mililitro. Para romper las células, vórtice la suspensión celular a la máxima intensidad de agitación durante un minuto, durante seis ciclos, con un período de enfriamiento de tres minutos en hielo después de cada ciclo. Después del vórtice, haga un agujero delgado en la parte inferior del tubo con una cuchilla de bisturí calentada y recoja la célula rota homogeneizar en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros helado con un giro de baja velocidad durante 10 segundos.
Centrifugar la célula recolectada homogeneizar a 5, 156 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los desechos celulares. Transfiera 450 microlitros de sobrenadante a un tubo de microcentrífuga helada de 1,5 mililitros y agregue un mililitro de tampón homogeneizador helado complementado con un pmSF fresco milimolar. Para cosechar las membranas plasmáticas, centrifute la suspensión celular a 17, 968 veces G durante una hora a cuatro grados centígrados.
Retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón homogeneizador recién complementado con un PMSF milimolar. Luego afloje el pellet de membrana plasmática revolviendo con la punta de pipeta de 100 microlitros y vuelva a suspender el pellet repitiendo el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Mida la concentración de proteínas de la preparación de la membrana plasmática con un kit de ensayo de proteínas que sea compatible con tampones que contengan el agente reductor y el detergente.
Guarde las membranas plasmáticas a menos 80 grados centígrados o manténgalas en hielo para su uso inmediato. Vierta de cuatro a cinco mililitros de gel separador en el aparato de gel ensamblado hasta dos centímetros de la parte superior. Coloque cuidadosamente de uno a dos mililitros de 0.1% SDS en la parte superior y permita que el gel de poli acrilamida se ajuste durante 60 minutos a temperatura ambiente.
Después de una hora, retire la capa de SDS al 0,1% del gel separador polimerizado y enjuague el gel con agua destilada doble para eliminar los rastros de SDS. Vierta la mezcla de gel de apilamiento sobre el gel de separación. Coloque un peine en el gel de apilamiento y retire las burbujas de aire de alrededor del peine.
Luego deje que el gel de apilamiento se ajuste durante 60 minutos a temperatura ambiente. Retire el peine y luego enjuague las ranuras de gel con agua. Coloque el gel en el tanque de gel y llene el tanque de gel hasta la parte superior con un amortiguador de funcionamiento.
Mezcle de cinco a 10 microlitros de muestras de membrana plasmática con volúmenes iguales de dos veces el colorante de carga de proteínas e inmediatamente cargue la mezcla de muestra en ranuras de gel individuales, sumergidas en un tampón en funcionamiento. Cargue los marcadores de peso molecular de la proteína en el rango de 10 a 245 Kilodalton en una ranura separada para permitir la estimación del tamaño de fragmentos de proteínas individuales. Realice la electroforesis en gel a 200 voltios hasta que el tinte de carga azul llegue al fondo del gel.
Examine el gel para la fluorescencia GFP en gel con un sistema de imágenes en gel. Después de las imágenes fluorescentes, fije las proteínas en 10 a 20 mililitros de solución fijadora de gel de proteína mediante agitación suave del gel durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego enjuague dos veces durante 10 minutos con 10 mililitros de agua destilada doble y coloque el gel en 10 mililitros de solución de tinción coloidal de Kumasi con agitación suave durante una hora a temperatura ambiente para visualizar las bandas de proteínas.
Para una mejor visualización de las bandas de proteínas, desmante el gel una o dos veces en 20 mililitros de agua destilada doble durante una hora antes de grabar imágenes con el sistema de imágenes en gel. Se logró una alta frecuencia de transformación de Saccharomyces cerevisiae A D Delta Delta con el plásmido de control positivo PS2. No se obtuvieron transformadores Eurocell Prototron para el control negativo.
Se obtuvieron alrededor de 50 células URA prototrofas CDR1-mGFPHis transformantes después de incubar células transformadas AD Delta Delta en placas CSM menos URA durante tres días. Se eliminó el pequeño transformador que no puede crecer en las placas de agar YPG. Las muestras de CDR1-mGHPHis con concentraciones variables se cuantificaron con fluorescencia en gel.
Las intensidades de fluorescencia mGFP fueron lineales en todo el rango de concentración con una fluorescencia de fondo mínima. Variar la densidad celular indicó que la ruptura de 40 ODU de células produjo la más alta calidad de membranas plasmáticas con la mayor actividad de CDR1 ATPasa. Sin embargo, el rendimiento de las membranas plasmáticas aumentó en proporción al aumento de las densidades celulares.
La capacidad de 31 detergentes con diversas propiedades para solubilizar CDR1-mGHPHis a partir de membranas plasmáticas crudas de células AD Delta Delta, CDR1-mGHPHis se probó con la página SDS. Beta y alfa DDM y Fos-colina 13 fueron los mejores detergentes para solubilizar CDR1-mGHPHis. Sin embargo, Fos-colina 13 causar hidrólisis parcial de CDR1-mGHPHis.
La proteína de membrana plasmática cruda solubilizada con detergente al 1% se separó utilizando una columna de exclusión de tamaño superos seis aumentado de 10 300 GL. Los cromatogramas de maltósidos y proteínas extraídas de LMNG mostraron que la mayoría de los CDR1-mGHPHi eludían como un pico gaussiano de buena forma a 15,5 milímetros CDR1-mGHPHis solubilizados con detergentes que contenían glucosa aludidos como un pico agregado o agregado amplio. Los picos más altos para DDM indicaron que una gran parte de DMN G solubilizada CDR1-mGHPHis puede ser desnaturalizada.
En los cromatogramas FSCC para fos-colinas zwitteriónicas y dos detergentes no iónicos sólo Digitonin y dio un cromatograma similar a DDM. Fos-colina 13 dio un pico simétrico de forma afilada, pero aludió con un volumen de elución significativamente más bajo que el de DDM. La doble etiqueta optimizada también mejoró el rendimiento de purificación y ayudó a determinar la localización, el tráfico y la estabilidad térmica de las proteínas de membrana.
La tecnología de expresión heteróloga también se puede utilizar en la detección de fármacos de alto rendimiento y en la caracterización detallada de muchas otras proteínas de membrana.
