El objetivo general de este protocolo es la proyección de expresión de la construcción múltiple de la proteína arginina metiltransferasas en la producción a gran escala para obtener la cantidad de miligramo de la proteína para estudios bioquímicos, biofísicos y estructurales en el medio apoyado, modo rentable en la cobertura de la plataforma de expresión S, sistema de vectores de expresión de baculovirus. La Dra. Alma Seitova presentará los siguientes pasos. Diluya las células SF9 de crecimiento exponencial a la densidad celular final de 0,4 millones por mil en los medios de insectos sin suero, y vierta en el depósito de reactivos estériles.
Utilice una pipeta multicanal programable para sembrar 0,5 milésimas de las células SF9 diluidas en cada pozo de la placa de 24 pozos. Este volumen es suficiente para garantizar una cobertura uniforme de la superficie de trabajo del pozo. Al mismo tiempo, no diluye demasiado la mezcla de transfección, lo que permite la eficiencia de la transfección.
Etiquete un pozo de la placa como célula solamente, y utilícese como control para la comparación de la célula transfectada y no transfectada para evaluar si hay muestras potenciales de la infección. Incubar las placas a 27 grados hasta que sea necesario, aproximadamente una hora, para dejar que las células se adhieran a las placas de cultivo celular. Diluya el reactivo de transfección bien mezclado en el medio de insectos no compensado y en un depósito de reactivo estéril, y mezcle suavemente durante 10 segundos.
Utilizando una pipeta de 12 canales, transfiera 102 microlitros del reactivo de transacción diluido a una placa estéril de 96 MicroWell. Transfiera 10 microlitros de 0,2 microgramos por microlitro de ADN de bacmid recombinante al pozo correspondiente de la placa MicroWell de 96 pozos y mezcle agitando suavemente, tocando la placa desde los lados. Incubar la mezcla de transfección durante 15 a 20 minutos para una formación compleja.
Usando una pipeta ajustable de seis canales diseñada para la transferencia entre una placa de 96 y 24 pozos, superponga la mezcla de transfección en las células en cuanto a gotas en los pozos correspondientes de las placas de transfección, e incube durante cuatro horas a 27 grados. Para asegurar una distribución uniforme de la mezcla de transfección sobre la monocapa de las células, mezcle suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces durante el tiempo de incubación. De cuatro a cinco horas después del tiempo de transfección, agregue 1.5 mils de medios de insectos sin suero.
Complementarlo con un 10% final de suero fetal bovino inactivado por calor y un 1% antibiótico y antimicótico. Incubar células en una incubadora de 27 grados durante 72 a 96 horas. Mezcle suavemente las placas de transfección una vez al día cuando sea posible.
Busque signos de infección evidentes en las células transfectadas a las 72 a 96 horas después del tiempo de transfección. Cuatro a cinco días después de la transfección, los signos de infección deben ser evidentes en las células transfectadas en comparación con las células de control bajo un microscopio invertido, y los baculovirus recombinantes iniciales secretados en el medio de cultivo celular deben estar listos para recoger. Utilice un multicanal electrónico programable para permitir simultáneamente la recolección de virus P1, la infección de células SF9 recién sembradas en la infección de células de suspensión en sus 24 bloques de pozos con 150 microlitros de los virus P1.
Gire el resto de las acciones virales colectivas P1 durante 15 minutos, cubra los 24 bloques de pozos con cultivo en suspensión de las células SF9 infectadas con una lámina airpore. Incube el bloque de 24 pozos a 27 grados con agitación a 245 RPM durante 72 a 96 horas. Cuatro días antes del tiempo de producción programado, dividir exponencialmente el crecimiento de las células SF9, en una densidad celular final de 2 millones por mil en hilo dental de agitación de vidrio Erlenmeyer con deflectores en medios de insectos libres de suero que contienen 1% antibiótico final y antimicótico.
Este paso generará un cultivo en suspensión de células de insectos infectados y virus P2 en el sobrenadante para la infección de nuevas células en el lote de producción. Agregue los virus P2 correspondientes e incube las células infectadas a la temperatura más baja de 25 grados para retardar el crecimiento celular, temblando a 165 RPM en una coctelera orbital con un movimiento de una pulgada. Cuatro días antes del tiempo de producción programado, Semilla dos litros de células SF9 de crecimiento exponencial en medios libres de suero de insectos a la densidad celular de 1 millón por mil, en el matraz de agitación Fernbach de 2.8 litros.
Agite el matraz a 27 grados con agitación a 150 RPM. La científica investigadora Ashley Hutchinson demostrará el siguiente protocolo. Divida cuatro litros de células SF9 de crecimiento exponencial y medios libres de suero de insectos a la densidad celular final de 4 millones por mil en las botellas grandes de reactivos de cinco litros.
Agregue de 10 a 12 milésimas del cultivo en suspensión de las células de insectos infectados por el baculovirus. Incubar el cultivo infectado de las células SF9 en una coctelera sacudiendo 145 RPM a una temperatura más baja de 25 grados Centígrados durante 72 a 96 horas. Las cantidades miligramos de varias proteínas recombinantes de la familia PRMT expresas en la producción inmediata de baculovirus en células SF9 se utilizan para estudios bioquímicos de instrucción biofísica, como se puede observar en la figura cinco.
En el SGC, las estructuras cristalinas se resolvieron en depositado en el banco de datos de proteínas para las formas de longitud completa o truncadas de las proteínas PRMT4, 6, 7 y 9 con varias sondas químicas e inhibidores. Plásmidos de expresión para estos PRMTs fueron depositados para agregar la colección de genes por SGC y están disponibles para la comunidad de investigación. En este vídeo, hemos hecho hincapié en los elementos clave para el éxito de la expedición de cribado de su construcción múltiple de la proteína arginina metiltransferasas en la producción a gran escala en el sistema de expresión de baculovirus.
El uso de las pipetas multicanal ajustables y programables regulares, hizo que todo su proceso fuera más rápido que eficiente. El uso de alto rendimiento y menos tóxico celular para las células, reactivo de transfección para la generación de virus recombinantes llevó a un protocolo de transfección más rentable y este manejo celular. La infección del lote a gran escala para la producción de proteínas con cultivo en suspensión de baculovirus infectado en seis células redujo significativamente los trabajos en un paso lento en la amplificación vital del iniciador.
Es por ejemplo, centrifugamiento de esto con cultivo especial de células infectadas. Eso es, por supuesto, en excluido el manejo adicional de las células infectadas en evitar en su más apretado en la degradación del virus. El mantenimiento de la célula de cultivo en suspensión en esta escala de producción en el recipiente de cultivo fue de alto volumen de campo nos ayudó a superar la limitación del volumen de producción y adoptar una plataforma a gran escala.
Esto es muy útil para los laboratorios sin acceso a los biorreactores o espacio limitado en la tubería de producción. Aunque nuestro protocolo se haya descrito para las proteínas de la familia de las metiltransferasas de la arginina de la proteína, el mismo acercamiento se puede aplicar a cualquier otra familia de las proteínas que requiere la plataforma de la expresión para obtener una cantidad suficiente de su proteína para los estudios instructivos biofísicos biofísicos.
