Los anticuerpos monoclonales derivados se utilizan principalmente en reactivos inmunes terapéuticos de diagnóstico destacando la necesidad de producir anticuerpos estables y confiables en preparación de producción limitada. Los métodos descritos aquí demostraron que la producción de anticuerpos recombinantes podría aumentar la eficiencia de la producción de anticuerpos monoclonales y minimizar los costos asociados con la mano de obra y el tiempo. Los métodos se utilizan para desarrollar conjugados de fármacos de aminopeptidasa y anticuerpos basados en anticuerpos y otros productos terapéuticos, lo que ayuda a aclarar el papel de la NPA en la prevención y el tratamiento de infecciones bacterianas y virales.
Demostrando el procedimiento estará Yan Li, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar, inyecte intraperitonealmente 100 microgramos de proteína APN en los ratones hembra adultos seleccionados para un refuerzo final del antígeno. Después de tres días de inyección, recoja el bazo de los ratones y lávese con DMEM dos veces para eliminar la sangre y las células grasas.
Filtre la suspensión de las células del bazo con una rejilla de cobre de malla 200 para eliminar los restos de tejido y recolecte las células del bazo mediante centrifugación para eliminar la membrana del bazo. Sembrar las células de mieloma SP20 del ratón en un matraz de 25 centímetros cuadrados que contiene cinco mililitros de DMEM suplementado con 6% de suero bovino fetal y cultivar las células a 37 grados centígrados y 6% de atmósfera de dióxido de carbono para mantener la viabilidad celular. Después de cinco a seis días de cultivo, las células deben alcanzar el 80 al 90% de confluencia después de la reanimación y aparecer redondas, brillantes y claras bajo el microscopio.
Un día antes de la hibridación, recolecte macrófagos de las cavidades peritoneales de los ratones. Siembre macrófagos peritoneales a una densidad de 0.1 a 0.2 veces de 10 a quinto por mililitro en placas de 96 pocillos, cada una con 100 microlitros de medio HAT e incubarlos durante la noche. Para la hibridación, aspire suavemente las células SP20 con una pipeta de 8 a 10 botellas y suspendalas en 10 mililitros de medio DMEM sin suero.
Lave las células con DMEM fresco y centrifugarlas dos veces, luego resuspenderlas en 10 mililitros de DMEM. Mezcle las células del bazo cuantificadas con células SB20 en una proporción de 10: 1 y transfiéralas a tubos de 50 mililitros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y recoja los gránulos en el fondo de los tubos.
Golpee el tubo para aflojar los gránulos antes de la hibridación. Usando un gotero, agregue un mililitro de polietilenglicol 1500 precalentado a 37 grados centígrados gota a gota al pellet de celda aflojado durante 45 segundos mientras gira suavemente el fondo del tubo. Luego, agregue lentamente un mililitro de DMEM precalentado a 37 grados centígrados a la mezcla durante 90 segundos, seguido de otros 30 mililitros de DMEM fresco y coloque el tubo de fusión en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Después de la incubación, cosecha las células. Resuspender el medio HAT y cultivar en una placa de 96 pocillos inoculada con macrófagos peritoneales. Después de cinco días, agregue 100 microlitros de HAT medio fresco a cada pocillo.
Y nuevamente después de cinco días de incubación, reemplace el medio con medio HAT. Utilice una placa de microtitulación recubierta con cinco microgramos por mililitro de proteína APN diluida en PBS molar 0,05 para analizar anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de hibridomas mediante el ensayo ELISA. Cultivar la pET28a más anticuerpos recombinantes aminopeptidasa NBL21 transformó bacterias en presencia de 0,4 milimolares beta-d-1-tiogalactopiranosida en un agitador orbital a 37 grados centígrados durante 10 horas.
Siembre 100 microlitros 0.5 veces 10 a la quinta célula de ovario de hámster chino por pocillo en una placa de 96 pocillos para incubación a 37 grados centígrados y una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante 18 a 24 horas. Cuando las células alcancen 80 a 90% de confluencia, diluir el pIRES2-zs Green uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasa y plásmido con Opti-MEM a una concentración final de 0,1 microgramos por microlitro. Después de cinco minutos, mezclar los 50 microlitros de pIRES2-zs Green diluido uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasas y plásmido con un microlitro de Lipofectamina 2000 y 49 microlitros de Opti-MEM.
Después de 20 minutos de incubación, agregue 100 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga células CHO. De cuatro a seis horas después de la transfección, reemplace el medio con DMEM F12 suplementado con 10% FBS. Después de 48 horas de incubación, agregue 400 microgramos por microlitro G418 a cada pocillo para seleccionar las células transfectadas de manera estable.
Después de 10 días de selección usando DMEM F12 medio suplementado con 10% FBS y 400 microgramos por microlitro G418, clasifique las células con clasificación celular activada por fluorescencia. Diluir en serie las células positivas cosechadas. Sembrarlos a un promedio de 0.5 a 2 células por pozo en una placa de 96 pocillos y cultivar en una incubadora de dióxido de carbono al 6% de 37 grados centígrados.
En un análisis microscópico representativo, todas las células de los hibridomas parecían redondas, brillantes y claras. Los anticuerpos monoclonales purificados que poseen cadenas pesadas de 50 kilodalton y ligeras de 25 kilodalton fueron confirmados por SDS-PAGE y se encontraron en la ascitis purificada. Los títulos de estos anticuerpos monoclonales anti-APN en sobrenadantes de cultivo y ascitis se muestran aquí.
El isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón reveló que los anticuerpos derivados de los clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 y 6C56 poseían subclases de inmunoglobulina G2B, mientras que APN 2A20 era un anticuerpo tipo kappa de inmunoglobulina G2A y un anticuerpo monoclonal APN 3FD9, 3F10 y 10F3 pertenecían a cadenas ligeras kappa de tipo M de inmunoglobulina y procesadas. La mayoría de estos anticuerpos monoclonales mostraron valores AV de más del 50%, lo que indica que se dirigieron a diferentes epítopos en el APN, mientras que el anticuerpo APN 5C51 reconoció epítopos antigénicos como los reconocidos por los anticuerpos monoclonales APN 3C48, 5B31 y 6C56. El gen APN 5B36 VHVL amplificado se ligó en un vector pET28a positivo o pIRES2-zs Green one para construir los plásmidos de expresión recombinante pET28a positivo RABS APN y pIRES2-zs Green uno RABS APN respectivamente.
Los anticuerpos expresados tanto por pET28a más anticuerpos recombinantes aminopeptidasa NBL21 y pIRES2-zs Green uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasa células NCHO se purificaron y analizaron mediante ensayos ELISA e IFA. Sin embargo, sólo el anticuerpo expresado en el sobrenadante de pIRES2-zs Green uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasa NCHO células reconocen la proteína APN. La unión de anticuerpos monoclonales APN 5B36 a proteínas APN alcanzó un equilibrio antes que los anticuerpos recombinantes.
La purificación de los anticuerpos monoclonales en el sobrenadante utilizando agarosa de la proteína A es mejor que el uso de precipitación de sulfato de amoníaco saturado.
