Este estudio presenta un nuevo flujo de trabajo para detectar el SARS-CoV-2 en superficies que rara vez se limpian en el entorno urbano, como las manijas de las bombas de gas, los parques infantiles y los cajeros automáticos. En una pandemia, los suministros son escasos. Utilizamos materiales y reactivos de fácil obtención y equipos disponibles en entornos básicos de laboratorio.
Utilizamos un método de extracción que preserva el ARN sin una cadena de frío, y un método de detección resistente a los inhibidores. Este protocolo es de interés para la salud pública. Proporciona un marco para la evaluación de los reservorios virales ambientales para la actual pandemia de COVID-19 y otros agentes infecciosos durante futuros brotes globales.
Reclutar científicos ciudadanos utilizando un llamado directo y claro a la acción lanzado a través de las redes sociales y locales. Cree un identificador de redes sociales para conectar el tema a través del contenido de las redes sociales. Cree un enlace al SMP, proporcionando un plug-in multilingüe para permitir la navegación en varios idiomas para que las personas soliciten participar en el esfuerzo de muestreo ambiental respondiendo a las preguntas relacionadas con la bioseguridad especificadas en un formulario en línea.
Incluir en el apartado de muestreo protocolos gráficos y audiovisuales en inglés y español. Visualice los datos geoespaciales utilizando una interfaz de programación de aplicaciones geoespaciales facilitada por un proveedor de servicios informáticos en la nube. Almacene los datos enviados al LIMS a través del SMP para facilitar el almacenamiento centralizado, el seguimiento de los flujos de trabajo de procesamiento y la gestión de la logística.
Cargar previamente información como el identificador del kit de muestra, el identificador de muestra, la fecha, la hora y las coordenadas del sistema de posicionamiento global para habilitar el cumplimiento del tipo de datos y minimizar el error. Incluya un enlace de solicitud de recogida de muestras para los participantes, que pueden usar una vez que hayan recogido todas las muestras. Construya un kit que contenga todos los suministros de muestreo, incluido el equipo de protección personal necesario, como máscara y guantes, un protocolo de muestreo e información relevante sobre bioseguridad.
El hisopo rara vez desinfecta las superficies en los hogares y el entorno urbano humedeciendo un hisopo absorbente de poliéster cuadrado de un centímetro con un detergente y frotando una superficie de 10 centímetros cuadrados. Con la ayuda de un palillo de dientes, sumerja cada hisopo de muestra en el tubo premarcado que contiene 200 microlitros de tiocianato de guanidinio. Use la máscara proporcionada y un nuevo par de guantes para la recolección de cada muestra para evitar la contaminación cruzada.
Después de terminar el muestreo, use el desinfectante de manos proporcionado. Guarde los tubos a cuatro grados centígrados hasta que sean transportados al laboratorio. Una vez que las muestras lleguen al laboratorio, guárdelas a menos 80 grados centígrados.
Para aumentar la velocidad de la selección, procese las muestras en piscinas. Si un grupo es positivo, extraiga el ARN de cada muestra de forma independiente. Combine las muestras de cada kit de muestreo en dos piscinas agrupando 50 microlitros de cada una de las ocho muestras en un tubo de microcentrífuga y guardando las muestras restantes a menos 80 grados Celsius.
Añadir 80 microlitros de cloroformo y vórtice durante 15 segundos. Luego incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Centrífuga a 13,000 veces G durante 20 minutos a cuatro grados Centígrados.
Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga. Guarde la interfaz restante y el líquido rosado en el congelador de menos 80 grados Celsius. Estas fracciones contienen ADN y proteínas.
Extraiga el ARN de la capa acuosa recuperada usando un protocolo crudo basado tiocianato del guanidinio de la extracción cruda del ARN. Prepare la mezcla de reacción RT-LAMP a temperatura ambiente con un volumen excesivo del 10% para tener en cuenta la pérdida de pipeteo. Agregue cinco microlitros de ARN a la reacción de la muestra y cinco microlitros de ARN más 2,5 microlitros de ARN sintético sars-cov-2 a la reacción con pinchos.
Añadir 2,5 microlitros de ARN sintético del SARS-CoV-2 al control positivo y cinco microlitros de agua al control negativo. Mezclar bien y girar hacia abajo las reacciones. Para la observación colorimétrica, un resultado negativo se indica con rosa y un resultado positivo se indica con amarillo.
Después de RT-LAMP, realice electroforesis en gel. La distribución de los sitios de recolección de muestras se muestra aquí. La mayoría de los kits estaban completos, y los datos correspondientes se cargaron en el LIMS.
El límite de detección a una frecuencia del 100% fue de 500 copias por cada 25 microlitros de reacción. En el RT-LAMP colorimétrico, las muestras positivas cambiaron de color de rosa a amarillo debido a un cambio de pH de ocho a 5,5. En números bajos de la copia, las muestras fueron funcionadas en un gel de la agarosa para confirmar los positivos con el escala-como patrón resultante.
Los métodos de RT QPCR se probaron con muestras ambientales. Todas las mezclas principales eran sensibles a los inhibidores en las concentraciones bajas del número de la copia del control positivo. En las concentraciones bajas de la plantilla, los métodos tradicionales de la polimerización en cadena de RT mostraron falsos positivos y falsos negativos.
Por último, una técnica llamada amplificación del círculo rodante detectó pequeñas cantidades de la secuencia objetivo. Sin embargo, demostró la amplificación de la punta de prueba en ausencia de una plantilla del ARN. Es vital lanzar un llamado a la acción que llegue a todos los sectores de la comunidad para que el muestreo realmente represente el riesgo de exposición de todos los miembros de esa comunidad.
Este marco detecta material genético del SARS-CoV-2. Los estudios para probar la viabilidad viral son el siguiente paso.
