Los hepatocitos primarios de ratón son importantes en los estudios hepáticos. Especialmente para el metabolismo de la glucosa y las pruebas de drogas hepáticas. En cuanto al tiempo, el proceso de aislamiento puede llevar mucho tiempo y la energía es costosa.
Este protocolo puede proporcionar una forma eficiente de aislar los hepatocitos primarios de ratón. Es amigable con el tiempo y el trabajo. Requiere muy pocos pasos con todas las regiones disponibles comercialmente.
Comience usando la bomba peristáltica para comenzar a bombear agua destilada doble calentada a una velocidad de 4 ml por minuto, durante cinco minutos. Luego cambie el tubo de bombeo de agua a medio de perfusión calentado. Monitoreo de la burbuja de aire entre el agua y el medio de perfusión.
Ayudará a rastrear el flujo del medio de perfusión a través del sistema. A continuación, desinfecte el abdomen de un ratón hembra C57 negro 6J anestésico de ocho semanas de edad con 70% de etanol. Y usando una tijera, corte el abdomen para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior.
Luego detenga la bomba peristáltica. Después de asegurarse de que el tubo de bombeo contiene medio de perfusión y no agua. Inserte un catéter de calibre 24 en la vena cava inferior.
Vuelva a encender la bomba y abra la vena porta. Mientras se bombea el medio de perfusión, presione la vena porta cada minuto para que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Continúe bombeando durante aproximadamente tres a cinco minutos o hasta que el líquido eliminado esté limpio.
A continuación, cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio de dispasa de colagenasa. Y presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Continúe bombeando hasta que se agoten los 25 ml del medio de dispasa colagenasa.
A continuación, aísle todo el hígado sin la vesícula biliar. Y lo colocamos en 30 mL de medio de lavado en una placa de Petri sobre hielo. El uso de fórceps rompe el hígado en pedazos para liberar hepatocitos primarios en la solución.
En esta etapa, el medio de lavado se convierte en una solución turbia que contiene hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado. Filtre esta solución turbia a través de un colador de células de 70 micras, en 20 mL de 1X por llamada HBSS en un tubo de 50 mL sobre hielo. Y mezcle la solución invirtiendo el tubo 20 veces.
A continuación, centrífuga la solución. Luego, en la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Y lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.
Pellet las células una vez más con centrifugación. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml de medio de cultivo. Cuente las células y colóquelas en placas de cultivo deseadas.
Según el diseño experimental. Después del recubrimiento, los hepatocitos primarios aislados se unieron firmemente por una hora y se expandieron completamente después de 12 horas. En los hepatocitos aislados, los niveles de ARNm de los marcadores de hepatocitos, como transtiretina, CD95, ASGR1 y ASGR2 aumentaron significativamente en comparación con todo el hígado.
En contraste, la presencia de células inmunes, células estrelladas y células endoteliales fue menor. Como lo demuestra una fuerte disminución en los niveles de ARNm de CD45, colágeno tipo 1 alfa 1 y célula endotelial 2 quinasa 2. Lo que sugiere que este protocolo puede reducir en gran medida la interferencia de otras células hepáticas.
Después del recubrimiento, los niveles de ASGR1 y ASGR2 disminuyeron con el tiempo, pero permanecen comparables a todo el hígado hasta el punto de tiempo de 12 horas. Especialmente para ASGR1. El nivel de expresión de CD81 unido a la membrana fue consistente hasta por 48 horas.
En comparación, la expresión del receptor 4 tipo toll generalmente aumentó y se volvió más alta que los niveles in vivo después de 48 horas. Los ensayos de sensibilidad a la insulina demostraron que la insulina promovió significativamente la fosforilación de ambos AKT en la serina 473. Y la caja de tenedor 01 en la serina 256, en los hepatocitos.
Indicando la sensibilidad de los hepatocitos primarios a la insulina. Los niveles de proteína fosfoenolpiruvato carboxiquinasa aumentaron significativamente después del tratamiento con glucagón. Sugiriendo que la vía de producción de glucosa se activó.
Esta activación se confirmó aún más por el aumento de la producción de glucosa. Y con otros estimuladores de producción de glucosa como Forskolin+IBMX. Este protocolo puede ahorrar tiempo y energía para estudios con hepatocitos primarios de ratón.
Siguiendo este protocolo, se pueden llevar a cabo experimentos relacionados, como el hipotético metabolismo de la glucosa y los ensayos de biomarcadores farmacéuticos.
