Este método puede ayudar a investigar las diferencias dependientes del sexo en los nichos neurogénicos, y a entender su neuroplasticidad, cambios que subrayan las interacciones sociales en la pradera vole. El ensayo de las neuroesferas es una excelente herramienta para determinar el potencial de proliferación y diferenciación de células madre neurales y progenitoras. Para empezar, coloque un plato de Petri en una superficie rodeada de hielo.
Deposite el cerebro en el plato y agregue 20 mililitros de solución de lavado en frío. En el plano coronal, divide el cerebro en dos bloques de tejido usando un bisturí, realizando el corte a nivel de bregma en el eje anterior-posterior. Extraiga la zona subventricular, o VZ, el tejido del bloque rostral y el tejido dentato gyrus, o DG, del bloque caudal.
Para diseccionar el VZ, sostenga uno de los hemisferios con un fórceps Dumont, e inserte las puntas finas de un segundo fórceps debajo del tejido que recuesta los caudados-putamen. Abra los fórceps a lo largo del eje dorsal-ventral para separar el tejido, y recoja el VZ en un tubo centrífugo con dos mililitros de solución de lavado en frío. No acose el tejido de más de dos animales.
Repita la microdisección en el otro hemisferio y almacene el tubo con el tejido en hielo. Para diseccionar la DG, utilice un bisturí para hacer un corte coronal en el bloque caudal, para obtener dos rebanadas en las que se observa la formación del hipocampo. Utilice fórceps Dumont para sostener una de las rodajas y haga un corte horizontal entre DG y CA1 con otro fórceps.
A continuación, haga una incisión vertical entre la DG y CA3, para separar la DG. Repita la disección en el otro hemisferio de la primera rebanada, luego en ambos hemisferios en la segunda rebanada. Recoger las cuatro piezas DG de cada vole en un tubo centrífugo. Coloque los tubos centrífugos dentro del gabinete de bioseguridad y espere aproximadamente 10 minutos hasta que los fragmentos de tejido se precipiten por gravedad.
A continuación, retire la solución de lavado y agregue un mililitro de solución enzimática caliente a cada tubo. Incubar los tubos a 37 grados durante 10 minutos. Para desintegrar los fragmentos de tejido, pipetearlos hacia arriba y hacia abajo con una punta de un mililitro, pero no pipetee más de 30 veces.
Repita la incubación a 37 grados centígrados y, a continuación, vuelva a pipetear el tejido. Añadir nueve mililitros de medio N-2 a cada tubo para diluir el tratamiento enzimático, y centrifugar los tubos a 200 veces g durante cuatro minutos. Desechar el sobrenadante, lavar las células con 10 mililitros de N-2 medio, y repetir la centrifugación.
Retire el sobrenadante de cada tubo y resuspendir los pellets celulares del VZ y DG en dos mililitros y un mililitro del medio B-27, respectivamente. Filtre cada suspensión celular con un colador celular de 40 micrómetros para eliminar cualquier tejido no digerido. Cultivo de las células filtradas en una placa de 24 pozos de unión ultrabajo, utilizando dos pozos para el VZ y uno bien para la DG. Añadir 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos 2, y 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico a cada pozo, luego incubar la placa a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y alta humedad durante 48 horas.
Después de la incubación, eliminar la mitad del medio de cultivo y reemplazarlo por B-27 medio fresco, complementado con dobles concentraciones de los factores de crecimiento. Repita este proceso cada tercer día. En los días en que no es necesario cambiar el medio de cultivo, añadir factores de crecimiento a una concentración final de 1X.
Las neuroesferas se formaron a partir de las células madre neurales aisladas de la zona subventricular y el giro dentuado de los voles de las praderas adultas femeninas y masculinas. Aunque había escombros en el cultivo primario, sólo las neuroesferas estaban presentes después del primer pasaje. Se obtuvo un mayor número de neuroesferas de la zona subventricular femenina que de la zona subventricular masculina, o el giro dentado tanto de mujeres como de hombres, lo que sugiere que el número de neuroesferas obtenidas depende de la zona proliferativa y del sexo vole.
El diámetro de las neuroesferas se midió en los días 8, 11 y 14. Aumentó progresivamente para los voles masculinos y femeninos en ambas regiones neuronales, pero las neuroesferas derivadas de los cerebros masculinos eran más pequeñas en comparación con las derivadas de los cerebros femeninos. Las neuroesferas adheridas se caracterizaron en el día seis en presencia de factores de crecimiento, o en el día 15 sin factores de crecimiento.
En el sexto día, en condiciones indiferenciadas, las células derivadas de la neurosfera expresaron Nestin, un marcador para los progenitores neuronales. También fue posible identificar las células doblecortina-positivas y el marcador de proliferación Ki-67, que indican la presencia de precursores neuronales o neuronas inmaduras. Sin embargo, la falta de colocación de Ki-67 con DCX sugirió la presencia de neuroblastos postmitéticos.
En el día 15, en condiciones de diferenciación, se encontraron neuronas maduras y células con el fenotipo glial, demostrando el potencial de diferenciación de las células aisladas. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que ser capaz de reconocer y tener práctica previa en la microdisección es fundamental para aislar sólo las células de los nichos neurogénicos. Siguiendo este protocolo, se pueden diseñar experimentos para identificar mecanismos implicados en la proliferación, diferenciación y supervivencia del tallo neural y las células progenitoras, procesos que aún se desconocen en la pradera vole.
