Este video introduce un método rápido y eficiente para la síntesis de nanopartículas magnéticas y el uso de magnetometría para fotografiar la transformación en el entorno biológico. Las nanopartículas magnéticas han atraído una mayor atención para aplicaciones biomédicas, y es importante entender ese destino una vez interiorizado en las células. Esto se logra aquí midiendo el magnetismo celular.
Tanto para la síntesis de nanopartículas magnéticas como para las mediciones, el resultado podría verse afectado por la contaminación. Utilice viales químicos bien limpiados y asegúrese de que el equipo del magnetómetro esté libre de contaminación. El soporte de muestras de magnetometría se utiliza generalmente para muestras de polvo.
Mostramos cómo adaptar el uso del soporte a muestras líquidas o biológicas. En un vial de vidrio de onda de maná de 30 mililitros disuelve 400 miligramos de acetilcenato de hierro tres en 10 mililitros de alcohol bencílico. Usando un reactor de microondas, calienta la suspensión de 25 grados Celsius a 250 grados Celsius a una velocidad de 11.25 grados Celsius por minuto, y mantenla en 250 grados Celsius.
Para separar las nanopartículas, aplique un imán de neodimio durante 30 minutos. Para peletizar las nanopartículas, realice una serie de lavados utilizando 10 mililitros del líquido de lavado designado y aplicando un imán de neodimio durante cinco minutos. Retire el filtrado y agregue 12 mililitros de 10 al menos dos ácido clorhídrico molar.
Centrífuga la suspensión y un filtro de 100 kilodalton a 2.200 veces G durante 10 minutos. A continuación, resuspend las nanopartículas en 10 mililitros de 10 a menos dos ácido clorhídrico molar. Prepare la solución de molécula de recubrimiento como se describe en el manuscrito.
Añada la dispersión acuosa de nanopartículas de 10 mililitros a la solución de molécula de recubrimiento a una proporción de masa de cinco a uno entre las moléculas de recubrimiento y las nanopartículas. A continuación, agitar la mezcla durante dos horas a temperatura ambiente utilizando un agitador magnético. Una vez completada la reacción, ajuste el pH de la mezcla a siete utilizando un hidróxido de sodio molar.
Cuando el cultivo de células madre mesenquimales humanas esté en el paso cinco y 90% confluente, retire el medio y enjuague las células con RPMI sin suero sin glutamina. A cada matraz de cultivo de 150 centímetros cuadrados, agregue 10 mililitros de la suspensión de nanopartículas. Incubar los frascos a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 30 minutos.
A continuación, deseche el medio que contiene la suspensión de nanopartículas y lave las células una vez con RPMI 1640 libre de suero. Añadir DMEM complementado con 10%FBS y 1%penicilina estreptomicina. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono para permitir la internalización completa de las nanopartículas.
Añadir 10 mililitros de 0.05% trypsin EDTA prewarmed para 37 grados Celsius a cada matraz de MSCs con etiqueta magnética. Después de dos a tres minutos, cuando las células se separan, inactivar inmediatamente la trypsin mediante la adición de un tercio del volumen de DMEM suplementado pre-advertido. Centrífuga las células separadas a 260 veces G durante cinco minutos.
Aspirar el medio y resuspend las células en un pequeño volumen de medio de cultivo esferoide celular a una concentración de aproximadamente 200.000 células por cada 50 microlitros. Agregue un mililitro de medio de cultivo de esferoide celular recién preparado a un tubo centrífugo cónico estéril de 15 mililitros. A continuación, agregue un volumen de suspensión celular correspondiente a 200.000 celdas.
Centrífuga estas células etiquetadas magnéticamente a 180 veces G durante tres minutos con el fin de formar un pellet celular en la parte inferior del tubo. Luego coloque el tubo en la incubadora a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono, manteniendo la tapa ligeramente abierta para el intercambio de gas. Coloque un volumen dado de nanopartícula magnética o una suspensión fija de una sola célula-esferoide en el magnetómetro de la muestra vibratoria, o VSM, soporte de muestra.
Si es necesario, la cinta PTFE se puede utilizar para evitar cualquier fuga. Inserte el soporte de muestra en el VSM y busque el desplazamiento de la muestra. Coloque la muestra en la posición correspondiente al máximo de magnetización.
Realice la primera medición en un campo magnético bajo entre 1.500 ersteds negativos y positivos 1.500 ersteds a una velocidad de 20 ersteds por segundo. Realice una segunda medición en un campo magnético alto entre cero ánadas y 30.000 ersteds positivos a una velocidad de 200 ersteds por segundo. 10 microlitros de nanopartículas dispersas en una solución acuosa se midieron en el magnetómetro vibratorio de la muestra.
La pendiente de la segunda parte de la curva es la constante diamagnética, que representa la señal diamagnética del agua y el soporte de la muestra. Esta constante diamagnética fue restada del momento magnético de la solución para obtener el momento magnético de las nanopartículas solamente. A continuación, se determinó el momento magnético de saturación.
Las nanopartículas recubiertas fueron interiorizadas en células madre. Las imágenes del microscopio electrónico muestran las nanopartículas recubiertas de citrato y recubiertas de PAA confinadas en los endosomas. Después de que las células fueron peletadas por centrifugación, formaron un esferoide celular que se puede mantener en cultivo durante largos períodos de tiempo.
Los esferoides celulares individuales también se midieron usando el VSM y el momento magnético de saturación se utilizó para calcular la cantidad de nanopartículas en una muestra celular. Se encontró que la absorción de las nanopartículas dependía de su concentración de incubación. Una disminución en el magnetismo de los esferoides celulares con el tiempo indicó la biodegradación de las nanopartículas, que fue confirmada por microscopía electrónica.
La degradación fue más sustancial en las nanopartículas recubiertas de citrato que en las nanopartículas recubiertas de PAA. Utilizando magnetometría, la degradación de las nanopartículas magnéticas dentro de las células se puede cuantificar con precisión, y se puede evaluar el impacto del futuro de las nanopartículas en los interesados en el comportamiento crudo. En este protocolo, las mediciones de magnetometría se realizaron en esferoides celulares, pero se pueden extender a las células en suspensión o a órganos.
Con el método descrito, usted es capaz de explorar las interacciones de nanopartículas magnéticas de nuevo diseño en diferentes sistemas celulares de interés, pero también se puede seguir su biodistribución in vivo y el destino.
