Este protocolo se ha utilizado durante más de 40 años y sigue siendo el único método fiable para los ensayos de trasplante de células mamarias en la rata. Este método se utiliza ampliamente para interrogar los efectos autónomos de células mamarias frente a los efectos del huésped en la investigación de la susceptibilidad al cáncer de mama. Mediante el injerto en la almohadilla de grasa interescapular, este método elude tener que limpiar el epitelio de membrana endógena que no es eficaz en ratas.
Por lo tanto, el método es menos invasivo y las glándulas mamarias endógenas se pueden utilizar como control interno. Para comenzar este procedimiento, coloque una rata hembra eutanasia en su espalda y fíjela con alfileres. Rocíe toda la superficie ventral con 70% de etanol.
Haga una incisión en forma de Y sagital que permita el acceso a las glándulas mamarias torácicas, abdominales e inguinales. Usa tijeras para diseccionar todo el tejido de la glándula mamaria de la rata donante y eliminar todos los ganglios linfáticos visibles. A continuación, utilice fórceps para extraer el tejido mamario.
Colóquelo en un plato etiquetado de 60 milímetros que contenga 500 microlitros de medios DMEM F12 sin suero y manténgalo en hielo. Luego usa tijeras para picar finamente el tejido mamario. Primero, gire cuidadosamente el cuerpo del animal donante para colocarlo en una posición propensa y asegurarlo con alfileres.
Rocíe la cabeza y la parte superior de la espalda con 70% de etanol. Localiza la base del cráneo y haz una incisión debajo de los cóndilos occipitales, inserta tijeras afiladas debajo de la piel y corta la piel lejos del cráneo incluyendo los lados de la cabeza. A continuación, utilice cortadores óseos o tijeras fuertes para cortar el cráneo a lo largo de la línea media desde el occipital hasta los huesos frontales, asegurándose de mantener la hoja lo más superficial posible y en ángulo hacia arriba para evitar la destrucción del tejido cerebral subyacente.
Usa Rongeurs o fórceps fuertes para despegar el hueso. Inserte la herramienta lateralmente al cerebelo para romper el hueso a cada lado. Cortar las conexiones con las meninges exponiendo completamente el canal auditivo.
Usa fórceps curvados de punta fina para sacar el cerebro del cráneo y registrar su peso. Use un nuevo comienzo de suministros para cerebros de donantes adicionales. Transfiera inmediatamente a un tubo de 15 mililitros que contenga la misma cantidad de medios que se almacena en hielo.
Homogeneizar el cerebro durante 10 a 15 segundos a baja velocidad. A continuación, filtre el homogeneizar para eliminar piezas grandes. Almacene el líquido sobre hielo hasta que sea necesario.
En primer lugar, corte un centímetro del extremo de una punta de pipeta de 1.000 microlitrotro y colóquela manualmente en el pipeteador. Utilice una punta de pipeta cortada para transferir el tejido del donante picado de cada plato de 60 milímetros al tubo de digestión de la colagenasa. Mezcle suavemente el tejido picado pipeteándolo hacia arriba y hacia abajo de una a dos veces.
A continuación, fije las muestras en una posición horizontal en la incubadora de agitación. Permita que las muestras digieren durante 1,5 a dos horas a 37 grados centígrados mientras agita a una velocidad entre 200 y 220 RPM. Cuando el tejido de la glándula mamaria del donante está completamente digerido, centrifuga la suspensión a 1.200 veces g y a cuatro grados centígrados durante 10 minutos.
Después de asegurarse de que se ha formado un pellet, utilice una pipeta para eliminar la capa de grasa o vierta cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender suavemente el pellet en 10 mililitros de medios DMEM F12 frescos. Repita este proceso para lavar a fondo las células.
Prepare un tubo de 50 mililitros con un colador de 40 micrómetros por cada animal donante. Pre-mojar el colador con al menos un mililitro de medios DMEM F12. A continuación, utilice una pipeta para pasar la suspensión celular a través del filtro para recoger fragmentos ductales u organoides.
Para los organoides, mantenga solo las células que permanecen en el filtro. Invierta el colador celular sobre un nuevo tubo de 50 mililitros y enjuague con cualquier volumen de medios estériles necesarios para recoger todas las células. Después de esto, peletizar las células una vez más y resuspend en un pequeño volumen de medios para el conteo.
Preparar lotes únicos de material de donante para todos los receptores de trasplante combinando volúmenes iguales de la suspensión celular con 50% de homogeneización cerebral para cada lugar de trasplante. Primero, identifique la base del cráneo y el inicio de la columna vertebral en un animal receptor. Aproximadamente un tercio del camino por la columna vertebral, afeite un área de tres centímetros por dos centímetros en la parte torácica superior de la espalda.
A continuación, prepare el campo estéril que se utilizará para la cirugía y organice todos los suministros necesarios. Enjuague las jeringas Hamilton con medios DMEM F12 estériles para evitar la pérdida de células. Cargue todo el volumen de material del donante en una jeringa separada para cada condición.
Después de que la jeringa esté completamente cargada, invierta y presione ligeramente el émbolo para eliminar las burbujas de aire en la punta de la aguja. Mantenga la jeringa sobre hielo durante todo el procedimiento. Asegúrese de que el animal no responde a estímulos profundos con un pellizco firme en los dedos del dedo.
Luego usa una cuchilla quirúrgica afilada para hacer una pequeña incisión interescapular. Localice el vaso sanguíneo medial para orientación y utilice fórceps para levantar la piel en un lado de la incisión. Mantenga la piel alejada de la almohadilla de grasa y evite la grasa marrón subyacente mientras se realiza el trasplante.
A continuación, inserte la aguja en el sitio del injerto. Inyecte cuidadosamente 40 microlitros de la mezcla celular en el tejido de la almohadilla de grasa blanca interescapular. Retire la aguja lentamente.
Mantenga el tejido en su lugar y permita que las células trasplantadas se asienten durante tres a cinco segundos. Repita todo el procedimiento de inyección como se describió anteriormente en el segundo sitio de trasplante. Después de esto, cierre la herida quirúrgica con clips de la herida o suturas y luego interrumpa la anestesia.
Después de sacrificar al animal, prepáralo para la disección. Identifique el vaso sanguíneo medial que separa los sitios del injerto en la almohadilla de grasa interescapular. Exéminar toda la almohadilla como una sola pieza de tejido.
Coloque el tejido en una corredera de microscopio cargada positivamente para todo el montaje. Coloque los portaobjetos en 70%etanol durante siete a 10 días para des-grasa el tejido. A continuación, prepare la mancha de carmín de alumna y procese las diapositivas cuando el tejido sea lo suficientemente opaco.
Cuando el procesamiento se haya completado y el tejido de la diapositiva se haya despejado, utilice microscopía de luz de baja potencia o fotografía digital de alta resolución para adquirir imágenes de las diapositivas para su análisis. En este estudio, las células epiteliales mamarias se trasplantan utilizando una técnica optimizada para trabajar con ratas donde los organoides epiteliales mamarios aislados de ratas donantes se injertan en la almohadilla de grasa blanca interescapular de las ratas receptoras. La presencia, ausencia o abundancia de epitelio se puede evaluar para determinar el éxito del experimento, así como la autonomía de los efectos relacionados con variables experimentales.
Un experimento de trasplante recíproco en el que cada factor tiene dos niveles, como el tipo salvaje frente al knockout, creará cuatro grupos de trasplantes para las pruebas de hipótesis. La almohadilla de grasa interescapular montada en todo el representante que se muestra aquí contiene un crecimiento epitelial positivo en ambos sitios de trasplante. Al analizar las diapositivas, la falta de epitelio en la almohadilla de grasa interescapular en muchas muestras puede indicar un problema técnico con el procedimiento y debe tratarse como un resultado negativo.
El crecimiento epitelial del donante también se puede comparar con la glándula mamaria endógena y puede facilitar conclusiones adicionales. En el ejemplo que se muestra aquí, los resultados del trasplante recíproco utilizando ratas noqueadoras DE tipo salvaje y DEKN1B sugirieron efectos autónomos de células no mamarias en el desarrollo de la glándula mamaria. Recuerde que las células epiteliales y los organoides del donante deben prepararse cuidadosamente y mantenerse vivos hasta que se inyecten en el animal receptor.
Es imperativo planificar con anticipación y realizar el procedimiento cuidadosamente y sin interrupciones. Los ensayos primarios de carcinogénesis se pueden realizar después del trasplante para interrogar la autonomía de las células mamarias en la etiología o el tratamiento del cáncer de mama. La edición génica también se puede incorporar para diseñar genéticamente las células donantes o la rata receptora.
Como único método para realizar el trasplante de células epiteliales mamarias en ratas, este procedimiento facilita el desarrollo de la glándula mamaria, así como los estudios de carcinogénesis. Esta técnica es particularmente importante para investigar las interacciones entre las células del cáncer de mama y/o las células epiteliales mamarias con el microambiente huésped. Permite estudios en el desarrollo de la glándula mamaria, así como la investigación del cáncer de mama.
Aquellos que intentan esta técnica por primera vez deben optimizar las preparaciones celulares de los donantes para asegurar el máximo rendimiento celular y viabilidad, luego realizar pequeños experimentos piloto para practicar procedimientos quirúrgicos y determinar los números celulares para inyectar y también determinar los tiempos de incubación postquirúrgicos necesarios para los experimentos.
