Este método captura interacciones proteicas transitorias en organismos como bacterias y levaduras y en diferentes tipos celulares. Aquí monitoreamos complejos de chaperona específicos formados transitoriamente que están involucrados en la proteostasis celular. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar información sobre la dinámica y localización subcelular de conjuntos procariotas y eucariotas.
Adaptaciones de esta técnica en organismos unicelulares como bacterias y levaduras, permite a los investigadores utilizarla como una poderosa herramienta para investigar enfermedades relacionadas con infecciones microbianas. Esta técnica podría emplearse potencialmente para analizar las interacciones proteicas en casi todos los organismos simplemente cambiando las condiciones en la fase de preparación de la muestra del protocolo. Es importante seleccionar anticuerpos de buena calidad que sean específicos y probados en inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ELISA o inmunoprecipitaciones.
Comience por pretratar diapositivas de diagnóstico de 10 pocóditos con poli-L-lisina. Añadir 100 microlitros de estéril y filtrado 0.0001%poli-L-lisina a cada pocóptero, e incubar los portaobjetos durante 30 minutos en una campana de flujo laminar estéril. A continuación, lavar cada pozo con 50 microlitros de agua estéril para eliminar el exceso de poli-L-lisina.
Agregue aproximadamente 15.000 células por pozo dependiendo del tipo de célula, y haga crecer las células en una incubadora húmeda estéril a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono a una confluencia de 60 a 80%. Después de 24 horas, retire el medio de crecimiento colocando un papel tisú en el borde de cada pozo, y lave las células tres veces con 50 microlitros de PBS. Luego fije las células agregando 50 microlitros de 4%paraformaldehído recién preparado en PBS a cada pozo e incubando el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Después de la fijación, lave la diapositiva tres veces sumergiendo la diapositiva en un frasco de manchas deslizantes con PBS. Para permeabilizar las membranas de las células adheridas, sumerja el portaobjetos en 100 mililitros de 0.5%Triton-X100 en PBS, e incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave las diapositivas tres veces en TBS-T.
Después del último lavado, retire el exceso de tampón con un papel tisú. Cultivar y diluir las células de S.cerevisiae de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego transferirlas a un tubo centrífuga de 50 mililitros y pellets por centrifugación a 665 veces g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y resusppend las células en cinco mililitros de medio fresco.
Luego agregue 550 microlitros de 37%formaldehído para una concentración final del 4% e incubar el cultivo a temperatura ambiente durante 15 minutos para fijar las células. Después de la incubación, pele el suelo de las células, retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en un mililitro de 4%paraformaldehído recién preparado en tampón de lavado. Incubar las células a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Mientras tanto, preparar los portaobjetos de diagnóstico mediante la adición de 100 microlitros de 0.0001%solución de poli-L-lisina a cada pocóteo e incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lavar el exceso de poli-L-lisina con agua ultrapura y dejar que los toboganes se sequen al aire. Después del paso de incubación, lave las células dos veces con un mililitro de tampón de lavado por centrifugación.
Retire el sobrenadante y resusppend las células en el tampón de lavado. Pele el pasador de las células después del último lavado, y retire el sobrenadante y resusppend las células en un mililitro de tampón de lavado que contiene 1.2 molar sorbitol. Para digerir la pared celular, pele las células de nuevo y resuspendir las células en 250 microlitros de solución de liceas recién preparada.
Incubar las células a 30 grados centígrados durante 15 minutos con un suave temblor. Después del paso de digestión, lave las células tres veces en el tampón de lavado y resusppend las células en 250 microlitros de tampón de lavado que contiene 1.2 sorbitol molar. Agregue 20 microlitros de células re-suspendidas a cada pozo recubierto de poli-L-lisina, y permita que las células fijas y permeabilizadas se adhieran durante 30 minutos.
Lave los pozos tres veces con 50 microlitros de tampón de lavado para eliminar las células no adherentes, y proceda con el ensayo de ligadura de proximidad. Inicie el ensayo de ligadura de proximidad, o protocolo PLA, añadiendo una gota del tampón de bloqueo a cada pozo e incubar el portaobjetos en una cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Retire el tampón de bloqueo colocando un papel tisú en el borde de cada pozo, y lave las células dos veces en 100 mililitros de tampón de lavado A.Next, agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos primarios a cada pozo e incubar el portaobjetos durante 60 minutos a 37 grados Celsius en una cámara húmeda.
Retire la solución de anticuerpos primarios y lave los portaobjetos dos veces en el tampón de lavado A.Después del lavado, agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pozo e incubar el portaobjetos durante 60 minutos a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. A continuación, retire la solución y lave las diapositivas dos veces en el tampón de lavado A.A continuación, agregue 40 microlitros de la mezcla de ligadura de ADN que contiene el conector oligonucleótidos y ligasas de ADN, a cada pocús, e incubar el portaobjetos en la cámara húmeda a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, retire la mezcla de ligadura y lave los portaobjetos dos veces con el tampón de lavado A.Añadir 40 microlitros de mezcla de amplificación de ADN que contiene la polimerasa de ADN y los oligonucleótidos con etiqueta fluorescente a cada pozo, e incubar durante 100 minutos en la cámara húmeda a 37 grados centígrados.
Retire la mezcla de amplificación y lave los portaobjetos en 100 mililitros de tampón de lavado B durante 10 minutos por lavado. A continuación, lave los portaobjetos en 100 mililitros de tampón de lavado B diluido de uno a 100 en agua ultrapura. Agregue 20 microlitros de medio de montaje que contenga DAPI por pozo.
Cubra los pozos de la diapositiva con un resbalón de cubierta y cierre con esmalte de uñas. Este protocolo se utilizó con éxito para supervisar los conjuntos de chaperones transitorios formados entre proteínas distintas del dominio J y las proteínas de capó Hsp70 y J-dominio en células de HeLa, S.cerevisiae y E.coli. Las proteínas de dominio J de clase A y clase B fueron objeto de anticuerpos primarios muy específicos.
Cada uno de los signos fluorescentes rojos representa un complejo proteico formado entre dos proteínas distintas del dominio J en las células de HeLa. También se observan complejos similares de proteínas de dominio J de clase mixta en el eucariota unicelular S.cerevisiae, o levadura de panadero. Algunos de los puncti fluorescentes generados a partir del PLA eran más difíciles de resolver como focos individuales, debido al pequeño tamaño de la célula.
No se observó una formación compleja entre proteínas de dominio J de clase A y B en células de E.coli, lo que es consistente con estudios bioquímicos realizados con proteínas purificadas. Pero otros conjuntos de chaperona que involucran proteínas del dominio J y el acompañante Hsp70 fueron capturados usando el protocolo PLA. Los controles técnicos que carecieron de un anticuerpo primario contra una de las proteínas o chaperones del dominio J que interactúan en las reacciones PLA completas mostraron poca o ninguna formación de fluorescencia puncti en las células, lo que indica una falta de falsa amplificación positiva de la señal.
Para obtener resultados fiables utilizando el ensayo de ligadura de proximidad, verifique de antemano que los anticuerpos utilizados son de calidad suficiente. Además, tome precauciones para evitar la digestión excesiva de las células que contienen una pared celular.
