Desarrollamos un método riguroso para aislar las células de la leche materna humana para estudiar la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos, o ADCP, mediante fagocitos de leche materna contra los objetivos del VIH. Esta técnica facilita el aislamiento relativamente rápido y fácil de las células de la leche materna para evaluar la capacidad de las poblaciones de leucocitos para realizar ADCP. Demostrando el procedimiento estará Alisa Fox, una técnico de mi laboratorio.
Después de seleccionar un antígeno objetivo relevante, utilice un kit comercial para biotinilar la proteína de interés de acuerdo con el protocolo del fabricante. Y deposite la muestra biotinilada en la cámara superior de una columna de espín. Añadir PBS hasta 400 microlitros y tapar la cámara antes de insertar la columna en un tubo de recogida para centrifugación.
Después de descartar el flujo a través, agregue PBS a 400 microlitros para una segunda centrifugación. Deseche el flujo a través, agregue PBS a 400 microlitros y mida la concentración de proteínas por un espectrofotómetro para conjugar la proteína biotinilada a microesferas micrómetros. Incubar seis microgramos de proteína con 12 microlitros de cuentas en 200 microlitros de PBS por placa de perlas conjugadas a temperatura ambiente durante dos horas, con vórtice suave cada 20 minutos.
Al final de la incubación, pele el pelado de las perlas conjugadas con proteínas por centrifugación y deseche el sobrenadante. Después de un vórtice suave, resuspender la proteína en 1200 microlitros de 0.1%BSA en PBS, y lavar el tubo por centrifugación dos veces más como se acaba de demostrar. Después del último lavado, resuspender el pellet en 1200 microlitros en PBS más BSA.
Para configurar las placas de ensayo ADCP, primero prepare 12 diluciones de microlitros de anticuerpos, o el suero inmune de interés, en 2%BSA en PBS en una placa redonda inferior de 96 pozos. Añadir 10 microlitros de perlas conjugadas por pozo a la placa durante una incubación de dos horas a 37 grados Centígrados. Al final de la incubación, añadir 200 microlitros de PBS más BSA.
Después de obtener leche materna humana de mujeres sanas lactantes que expresan usando una bomba, dentro de las cuatro horas de expresión separar el contenido de la leche por centrifugación y verter cuidadosamente la leche desnatada y grasa, dejando el pellet celular inalterado. Limpie el interior del tubo con una toallita sin pelusas para eliminar toda la grasa de la pared del tubo y agregue 10 mililitros de PBS más HSA. Resuspender el pellet con pipeteo suave para evitar la activación celular en la apoptosis, y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros para centrifugación.
Después de un segundo lavado en PBS más HSA como acabamos de demostrar, resuspender suavemente las células en uno a dos mililitros de PBS fresco más HSA para el conteo. Para un ensayo ADCP, invierta rápidamente la placa ADCP preparada para decantar el sobrenadante después de la centrifugación final y agregue cinco veces 10 en una cuarta célula de leche materna recién aislada en 200 microlitros de PBS más BSA durante una incubación de dos horas a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, centrifugar las células y lavar los pellets dos veces en 200 microlitros de PBS fresco como se demuestra.
Después del último lavado, manche las células con 0,5 microgramos por mililitro de vitilidad fijable de 450 por pozo en 50 microlitros de PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Al final de la incubación, pele en pellet las células para dos lavados en PBS fresco como se ha demostrado, y manchar las células para los marcadores de leucocitos de interés durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Al final de la incubación, recoger las células centrifugación, y lavar las células dos veces en 200 microlitros de 1%BSA más PBS por lavado.
Después del último lavado, fijar los pellets en 200 microlitros de 0.5%formaldehído por pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Para el análisis citométrico de flujo de las muestras celulares, establezca un citómetro de flujo equipado con un lector de placas de alto rendimiento para retirar 175 microlitros de muestra y recoger 5000 células por pozo. Realice el gating inicial para eliminar los dobletes y los desechos en una dispersión hacia delante frente frente a una gráfica de dispersión lateral.
Utilice una gráfica de dispersión lateral frente a la vituosa de viabilidad para eliminar las células muertas. Y utilice una gráfica de dispersión lateral frente a CD45 para diferenciar las principales clases de leucocitos. Para todas las células positivas CD45, o para cada subconjunto de leucocitos de interés, mida la actividad de la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo mediante un marcador en las células positivas del cordón en un histograma del canal de fluoróforo apropiado para las perlas conjugadas.
Luego calcule las puntuaciones de fagocitosis celular dependiente de anticuerpos como la mediana de la intensidad de fluorescencia de las células positivas del cordón por el porcentaje del CD45 total más las células de la población positiva. Aquí, se muestra la estrategia de gating para eliminar dobletes, escombros y células muertas. Entre uno y 12% del total de células vivas son típicamente leucocitos positivos CD45 con la mayor parte de la dispersión lateral baja a intermedia CD45 monocitos bajos que parecen ser precursores, o a células inmaduras, basado en la dispersión lateral versus CD45 gating.
Los supuestos granulocitos se definen como células intermedias CD45 de dispersión lateral alta. La medición de la actividad ADCP de las células de leche materna recién aisladas utilizando un anticuerpo monoclonal humano específico del VIH a un mes después del parto revela que el tratamiento con el inhibidor de la actina citocaplasina D y o los anticuerpos de bloqueo del receptor Fc antes de la incubación con perlas acopladas con antígenos unidos a anticuerpos da lugar a la actividad adCP igualada en o por debajo de la observada en presencia de anticuerpos de control. La puntuación ADCP determinada para el total de células positivas CD45 es comúnmente entre 25 a 35 veces por encima de los niveles de fondo, definido mediante un control negativo, anticuerpo monoclonal anti-antórax.
Cada muestra de leche materna es única y algunos pellets pueden ser difíciles de ver. Además, las poblaciones de leucocitos, y por lo tanto las puntuaciones ADCP, pueden variar inmensamente de una muestra a una muestra.
