Este protocolo nos permite responder a una variedad de preguntas sobre la forma en que el cizallamiento actúa sobre las células en la solución y proporciona un control significativo sobre la duración y magnitud del cizallamiento. A diferencia de otras técnicas, que detectan el efecto del cizallamiento en las células que están inmovilizadas, esta técnica nos permite aplicar cizallamiento a las células en solución y se presta a un espectro de métodos de detección de señal aguas abajo. Después de obtener sangre periférica de un donante adulto sano y consentidos en un tubo de 4,5 mililitros de citrato trisódico al 3,8%, centrifugar la sangre para obtener plasma rico en plaquetas y utilice una punta de pipeta cortada en un ángulo de 45 grados para eliminar cuidadosamente la capa plasmática superior, turbia y rica en plaquetas resultante.
Obtenga el recuento de plaquetas a través del hemograma completo y ajuste el recuento de plaquetas a aproximadamente 2,5 veces 10 a la quinta plaqueta por microlitro con plasma pobre en plaquetas humanas agrupados. A continuación, coloque la suspensión a 22 grados centígrados con una rotación suave. Para el tratamiento del ligando, agregue lentamente el anticuerpo o ligando de interés al plasma rico en plaquetas, y mezcle las plaquetas suavemente.
Durante la incubación, encienda el viscosímetro de placa de cono y ajuste la temperatura de la placa a 22 grados celsius. Después de cinco a 10 minutos, transfiera el plasma rico en plaquetas tratado al viscosímetro de placa de cono controlado por temperatura directamente en el centro de la placa, teniendo cuidado de que toda la muestra se deposite entre el cono y la placa en el punto de contacto. Para aplicar la cizalladura a la muestra, calcule la cizalla de acuerdo con el manual del viscosímetro y aplique la cizalla a la muestra a la velocidad y duración adecuadas.
Al final de la aplicación, levante el cono a unos dos milímetros de la placa, de modo que la muestra permanezca en contacto tanto con la placa como con el cono, y utilice una punta de pipeta de carga en gel para recoger de cinco a 10 microlitros del centro del volumen de la muestra. A continuación, incubar la muestra cizallada con anticuerpos contra los marcadores superficiales de interés durante 20 minutos a temperatura ambiente, y fijar las muestras en 2%paraformaldehído durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para analizar las muestras por citometría de flujo, recoja al menos 20.000 eventos para cada condición y cuantifique la intensidad de la señal de cada marcador fluorescente, utilizando el valor de altura para la intensidad de cada fluoróforo.
A continuación, utilice un control negativo con albúmina sérica bovina o vehículo para dibujar una puerta, excluyendo los eventos fluorescentes de fondo negativos, y cuantificar el porcentaje de eventos dentro de la puerta para todas las condiciones experimentales. La expresión del marcador de activación plaquetaria en respuesta a la aplicación de fuerza de cizallamiento no está regulada en función del tiempo. Aquí, se muestran lecturas representativas de la activación de plaquetas humanas en presencia de dos anticuerpos dirigidos al dominio N-terminal de la glicoproteína 1b-IX y un anticuerpo de control en condiciones estáticas y cizalladas.
La expresión de los tres marcadores de activación se incrementó significativamente en presencia de fuerzas de cizallamiento y anticuerpos dirigidos, en comparación con condiciones estáticas o en presencia de anticuerpos de control. En particular, el tratamiento con anticuerpos con una fuerza de unión demasiado baja para desencadenar la activación de la glicoproteína 1b-IX no desencadena la regulación de la regulación del marcador de activación plaquetaria en condiciones estáticas o de fuerza cortante. Además, el plasma de pacientes con trombocitopenia inmune que contiene anticuerpos contra la glicoproteína 1b-IX desencadena respuestas dependientes del cizallamiento en contraste con el plasma de pacientes sin glicoproteína 1b-IX dirigido a anticuerpos.
Además de los análisis flowcitométricos, las células que han estado expuestas a la cizalladura también se pueden utilizar para el análisis de manchas occidentales, ELISA y especificaciones de masa para determinar cualquier cambio en el nivel de proteína. Como siempre, cuando utilice sangre o muestras humanas, asegúrese de usar el equipo de protección adecuado y siga las pautas de seguridad de laboratorio y patógenos nacidos en la sangre de su institución.
