El propósito de este artículo es proporcionar un protocolo visual detallado y escalonado para extraer metabolitos acuosos de células cancerosas cultivadas para el análisis posterior del metaboloma. La principal ventaja de esta técnica es su simplicidad y fiabilidad para extraer metabolitos de células adherentes. Pero sobre todo, está bien optimizado para el análisis de metabolomas utilizando espectrometría de masas de electroforesis capilar o CEMS.
La metabolómica es una técnica poderosa para identificar biomarcadores o detectar cáncer en estadio temprano y predecir la respuesta de quimioterapia a los pacientes con cáncer. Usamos células cancerosas en esta demostración. Sin embargo, esta técnica también se puede aplicar para cosechar metabolitos de otras células adherentes como fibroblastos en células iPS.
Las concentraciones de metabolitos se normalizan en función del número de células viables. Tan cuidadosa preparación de la cultura, esta es la clave para obtener buenos datos reproducibles. Demostrando el procedimiento estará Ami Maruyama, un técnico de mi laboratorio.
Para empezar, placa HCC827 y PC-9 células en platos de 100 milímetros que contienen 10 mililitros de RPMI-1640 medio complementado con 10%fetal suero bovino. Coloque los platos en una incubadora en un 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 24 horas al cultivo. Después de la incubación, incline suavemente los platos de cultivo de 100 milímetros para aspirar los medios de cultivo celular.
Lave las células de cada plato con dos mililitros de solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio. Mece suavemente cada plato para que la solución PBS cubra completamente la superficie del plato, luego incline los platos para aspirar el tampón de lavado. Caliente 0.25%trypsin-EDTA solución a 37 grados Celsius.
Con una pipeta serológica de cinco mililitros, agregue dos mililitros de la solución calentada de trippsina-EDTA a cada plato. Mece suavemente cada plato para que la trippsina cubra completamente la superficie del plato. Incubar los platos de cultivo a 37 grados centígrados durante aproximadamente cinco minutos.
A continuación, agregue cuatro mililitros del medio de crecimiento completo precalentó a cada plato. Y pipetear suavemente varias veces para volver a suspender las células en el medio. Transfiera cada suspensión celular a un tubo cónico separado de 15 mililitros.
Centrifugar a 800 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender cada pellet celular en dos mililitros del medio de crecimiento completo precalentado. Mezclar 10 microlitros de la suspensión celular con 10 microlitros de 0,4% de solución azul tripano, en un microtubo de 1,5 mililitros.
Cargue 10 microlitros de la mezcla en una cámara de conteo celular deslizarse a través de la acción capilar. Inserte la diapositiva de la cámara en el contador de celdas automatizado y presione el botón de captura para capturar la imagen y mostrar los resultados del número total y el porcentaje de viabilidad de las celdas. Si el número total de células es superior a 0,5 millones de células por mililitro, añada un medio de crecimiento adicional al tubo cónico de 15 mililitros para obtener la concentración celular deseada.
Ahora, agregue dos a cinco mililitros del cultivo a cada plato de cultivo celular de 100 milímetros para sembrar aproximadamente una a 2 1/2 millón de células por plato. Incubar los platos de cultivo en 5% dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 18 horas. En primer lugar, en un matraz volumétrico de 15 mililitros, diluir una solución estándar interna comercial que contenga sulfola L-metionina y ácido D-Camphor-10-sulfónico 1.000 veces en agua ultrapura.
Disolver el manitol en agua ultrapura para preparar una solución de manitol de 0,05 gramos por mililitro en agua ultrapura como tampón de lavado. A continuación, en la taza de filtro de cada unidad de filtro centrífugo, pipeta 250 microlitros de agua ultrapura. Tapa las unidades de filtro firmemente, y centrifugar a 9, 100 veces g a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.
Compruebe el volumen de cada filtrado. Si se ha acumulado un filtrado significativo durante el primer giro corto, la unidad de filtro puede estar defectuosa. Deseche la unidad de filtro y utilice una nueva unidad de filtro en su lugar.
Cierre bien las tapas de las unidades de filtro y centrifugar de nuevo a 9, 100 veces g a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Asegúrese de que no quede agua ultrapura en ninguna de las tazas de filtro y retire el agua ultrapura filtrada en cada tubo de recogida con una pipeta. Vuelva a colocar las tazas de filtro en sus tubos de recogida y utilice las unidades de filtro centrífugos en una hora para evitar daños al secarse.
Saque los platos de cultivo de 100 milímetros de la incubadora y aspire el medio de cultivo celular de cada plato. Añadir 10 mililitros de medio de cultivo PBS con o sin 250 diamida micromolar a cada plato, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Incubar los platos de cultivo a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Después de la incubación, aspirar el medio de cultivo celular de cada plato de cultivo de 100 milímetros. Incline ligeramente el plato y agregue suavemente dos mililitros de 5% de tampón de lavado de manitol al borde de cada plato para lavar las células, teniendo cuidado de no perturbar la capa celular. Aspirar el tampón de lavado de cada plato de cultivo, y lavar las células de nuevo inclinando ligeramente el plato y agregando suavemente 10 mililitros de tampón de lavado por plato.
A continuación, aspirar completamente el tampón de lavado desde el borde de cada plato de cultivo. Ahora, agregue 800 microlitros de 99.7% metanol por plato de cultivo, y balancee suavemente cada plato de cultivo de ida y vuelta, para cubrir toda su superficie. Deje los platos a temperatura ambiente durante 30 segundos.
Añadir lentamente 550 microlitros de la solución estándar interna diluida por plato sumergiendo la punta de la pipeta en el metanol y pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, varias veces. Mece suavemente cada plato de cultivo de un lado a otro para cubrir toda su superficie, y dejar los platos a temperatura ambiente durante 30 segundos. A continuación, transfiera la solución extraída de cada plato de cultivo a un tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitros.
Centrifugar los tubos a 2.300 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera 700 microlitros de cada sobrenadante en dos unidades de filtro centrífugo, con 350 microlitros por unidad. Centrifugar los tubos del filtro a 9, 100 veces g a cuatro grados Celsius durante aproximadamente dos horas, hasta que no quede líquido en las tazas del filtro.
Retire las tazas del filtro y cierre firmemente las tapas de los tubos de recogida. En este estudio, las células HCC827 y PC-9 crecieron por igual durante tres horas. El análisis CEMS indica la diferencia entre las células tratadas con diamida y las células tratadas con PBS para ambas líneas celulares.
Entre ellos, varios intermedios en la vía del fosfato de pentosa y en la glucólisis superior fueron significativamente más altos en las condiciones tratadas con diamida, mientras que unos pocos intermedios de ciclo tricarboxílico fueron menores en las condiciones tratadas. Los perfiles de metabolomo de metabolitos intracelulares revelaron 175 y 150 metabolitos diferenciales en células HCC827 y PC-9, respectivamente. Después del tratamiento con diamida, el nivel de ácido glucónico y glucosa oxidada aumentó 12 veces en las células HCC827 y 10 veces en las células PC-9.
Del mismo modo, el nivel de glucosa 6-fosfato, una glucosa fosforilada en el primer producto de glucólisis catalizada por hexoquinasa, también aumentó 6.3-y 3.5-fold en las células HCC827 y PC-9, respectivamente. Además, los niveles de 6-fosfogluconato, el primer intermedio en la vía de fosfato de pentosa, aumentaron dramáticamente 89 veces en las células HCC827 y 231 veces en las células PC-9. Por el contrario, los niveles de otros intermedios glucolíticos como la fructosa 6-fosfato no cambiaron en la condición experimental de diamida.
Los niveles totales de fosfato de dinucleótido de nicotinamida adenina fueron casi equivalentes entre el tratamiento con diamida y las condiciones de control de PBS. El uso de la solución de 5%manitol, distinto de PBS, como tampón de lavado para las células de lavado es muy importante para el análisis de CEMS, porque los tampones a base de sal interfieren con el análisis y afectan negativamente a la medición. Este protocolo no es adecuado para la extracción de metabolitos hidrófobos como los lípidos, por lo que necesitamos desarrollar un protocolo para extraer convenientemente metabolitos hidrófilos e hidrófobos para un análisis más completo del metaboloma.
Esta técnica realiza una fácil extracción de metabolitos de casi cualquier célula adherente, y por lo tanto, es aplicable para una variedad de investigaciones como cáncer, células madre, farmacología, nutrición, y la ciencia cosmética.
