Nuestro sgRNA agrupado llamado el cribado de la biblioteca, es un poderoso enfoque genético para identificar y evaluar la función biológica de los elementos no codificantes en todo el genoma. Esta técnica nos permite examinar el efecto de alterar los sitios de unión asociados, límites cromáticos u otros elementos reguladores en la expresión de genes específicos. Nuestro enfoque se puede utilizar para identificar el papel del CTCF, los ARN y potenciadores no codificantes largos, en la regulación del gen HOX en el desarrollo embrionario temprano, así como ciertas leucemias con una firma aberrante del gen HOX.
Comience este procedimiento con el diseño de un sgRNA dirigido a sitios de enlace CTCF. Clonación de la biblioteca sgRNA en preparación de celdas como se describe en el protocolo de texto. Para empaquetar el lentivirus, cotransfectas células T HEK293 con 20 microgramos de vectores de biblioteca purificados, 15 microgramos del plásmido envasado y 10 microgramos del plásmido de la envolvente, durante 48 horas antes de la cosecha de los virus.
Después de 48 horas, recoger el sobrenadante del virus y filtrarlo a través de una membrana PVDF de baja unión a proteínas de 0,45 micras. A continuación, concentrar el sobrenadante lentiviral por 50 veces, utilizando el concentrador. Aliquot los virus concentrados y almacenarlos en un congelador de menos 80 grados centígrados.
Trabajar en pozos separados de una placa de 12 pozos para mezclar células MOLM13 con varias dosis del lentivirus concentrado para seis grupos totales. Centrifugar inmediatamente estas mezclas a 1000 veces g durante dos horas a 33 grados centígrados. Transfiera las 12 placas de pozo a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas.
Aspirar suavemente el sobrenadante sin alterar la paleta de celdas, y volver a suspender las células transducidas con RPMI 1640 Medium suplementado fresco. Luego transfiera las células re-suspendidas a matraces T25 e incubar a 37 grados centígrados durante 48 horas sin puromicina. Después de 48 horas dividir estas células en dos matraces, un grupo experimental tratado con un microlitro por mililitro de puromicina durante cinco días, y un grupo de control sin tratamiento con puromicina durante cinco días.
Mida el valor de MOI optimizado para la transducción dividiendo el número de células vivas tratadas con puromicina por el número de células sin tratamiento con puromicina. Para transducir las células con la biblioteca agrupada, infecte 1,5 millones de células MOLM13 en una placa de 6 pozos con 0,3 MOI de lentivirus agrupado de sgRNA en medio. Utilice las células sin la infección por lentivirus como control.
Centrifugar inmediatamente la placa de seis pozos a 1000 veces g durante dos horas a 33 grados centígrados para espinofecar las células. Luego, transfiera las placas de vuelta a la incubadora a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Aspirar suavemente el sobrenadante sin alterar la paleta de celdas y volver a suspender las células transducidas con un medio fresco.
Luego, transfiera las células a los matraces T25 e incubar a 37 grados centígrados durante 48 horas sin puromicina. Después de 48 horas, tratar las células con un microgramo por mililitro de puromicina durante cinco días. Intercambie por medio fresco después de dos días y mantenga una densidad celular óptima.
Semilla el clon único en 96 placas de pozo con métodos de dilución limitadores. Incubar estos clones individuales a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cultivarlos durante 3-4 semanas.
Cuente las células MOLM13 integradas sgRNA con una tinción de solución 0.4%Trypan Blue y luego transfiera 10.000 células vivas por pozo a una placa PCR de 96 pozos. Centrifugar la placa a 1000 veces g durante cinco minutos y luego retirar y desechar completamente el sobrenadante con una pipeta. Evite alterar la paleta de celdas.
Después de lavar las células como se describe en el texto añadir 50 microlitros de la mezcla maestra de la lysis celular a cada pozo. Pipetear hacia arriba y hacia abajo cinco veces para volver a suspender la paleta de celdas. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Luego, transfiera la mezcla a 37 grados centígrados durante cinco minutos, y luego 75 grados centígrados durante cinco minutos adicionales. Ahora agregue un microlitro de izado celular a los pozos de PCR que contienen la mezcla de reacción RT qPCR. Esta mezcla incluye los genes marcadores hacia adelante y hacia atrás, la transcriptasa inversa y la mezcla de reacción de un solo paso.
Ejecute la reacción de transcripción inversa durante 10 minutos a 50 grados centígrados seguido de la activación de la polimerización y la desnaturalización del ADN durante un minuto a 95 grados centígrados. Realice RT PCR con 40 ciclos de reacción PCR como se detalla en el protocolo de texto. Verifique los clones de expresión disminuido HOXA9 a través de la secuenciación de Sanger y realice PCR con ADN genómico MOLM13 como se describe en el protocolo de texto.
Extraiga y purifique los productos PCR con el kit de purificación de PCR. Ligar los productos de PCR purificados en el vector T con tampón de ligadura T4, ADN vectorial T, ADN PCR y ligasa T4. Coloque la mezcla de ligadura en una incubadora a 16 grados centígrados durante la noche.
Transfiera la mezcla de ligadura en células y placas alfa competentes DH5 sobre una placa de agar antibiótico de ampicilina LB. Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. Elija los clones individuales de la placa LB y verifiquelos mediante genotipado y secuenciación de Sanger.
Configure el grupo de mezclas heteroduplex con 200 nanogramos de la referencia y 200 nanogramos de amplificadores PCR de prueba en un tubo PCR de 0,2 mililitros. Incluya el grupo de mezcla homoduplex con sólo 400 nanogramos de amplificador pcR de referencia como control. Incubar por separado la mezcla heteroduplexa y homoduplex a 95 grados centígrados durante cinco minutos en un vaso de precipitados de un litro lleno de 800 mililitros de agua.
Luego, enfríe las mezclas gradualmente a temperatura ambiente para recocido y formar el heteroduplex u homoduplex. Ahora, digiere por separado 400 nanogramos de la mezcla heteroduplex y homoduplex recocido con un microlitro de nucleasa de detección de mutaciones ineléditas, y dos microlitros de tampón de reacción de nucleasa a 42 grados centígrados durante 60 minutos. Analizar las muestras digeridas con electroforesis de gel de agarosa.
El ADN de la mezcla heteroduplex debe cortarse en pequeños fragmentos y no se debe cortar el ADN homoduplex. sgRNA dirigido a clones positivos MOLM13 se confirmó con el método RT qPCR, basado en los niveles de expresión de los genes HOXA9 con la comparación con las células de control. De los 528 clones supervivientes proyectados, 10 clones mostraron más del 50% de reducción en los niveles de HOXA9.
los sgRNA integrados en los clones reducidos HOXA9, HOXA9 sin cambios y el aumento de HOXA9, fueron confirmados además por la amplificación de PCR del SGRNA y la identificación por secuencia de Sanger. Seis de cada diez clones que mostraban una reducción en los niveles de HOXA9 contenían sgRNAs dirigidos al sitio CBS79, según lo determinado por la secuenciación de Sanger. Las mutaciones indel de clones positivos de sgRNA integrados se determinaron mediante genotipado basado en PCR y digestión de nucleasas.
La eliminación heterocigota del sitio CTCF ubicado entre los genes HOXA7 y HOXA9 se identificó mediante genotipado basado en PCR. Los clones con reducción de HOXA9 de cinco, seis, 28 y 121 mostraron eliminación en la ubicación límite de CBS79. Se observaron resultados similares para las mutaciones indel en el sitio CBS79 que fueron analizadas por el ensayo de digestión de nucleasa.
Al realizar este procedimiento, es importante hacer cantidades iguales de heteroduplexos y homoduplexos para detectar mutaciones indeledas inducidas por sgRNA a través del ensayo de digestión de nucleasa. Nuestro enfoque permite la utilización del marcador seleccionado, para llevar a cabo la secuenciación de próxima generación en el gen objetivo para descubrir los efectos del gen en la leukemogénesis. En general, nuestro enfoque previene los RPC para la corrección funcional y la reducción de un elemento genético irregular observado durante el proceso biológico normal y la leukemogénesis en el error del proyecto del genoma póstumo.
